Tambahan Monografi
3-O-DESASIL-4'-MONOFOSFORIL LIPID A
3-O-Desacyl-4′-Monophosphoryl Lipid A
3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A adalah turunan detoksifikasi dari lipopolisakarida (LPS) Salmonella minnesota, galur R595, yang mempertahankan aktivitas imunostimulan dari LPS induk. Terdiri dari campuran kongener, semuanya mengandung rantai utama disakarida yang terikat β1ʹ→6 dari 2-deoksi2-aminoglukosa yang terfosforilasi pada posisi 4’, tetapi berbeda dalam substitusi asam lemak pada posisi 2,2ʹdan 3ʹ. Aktivitas imunostimulan dari 3-Odesasil-4’-monofosforil lipid A dikombinasikan dengan vaksin termasuk pengaturan molekul costimulator pada antigen-presenting cells dan sekresi sitokin proinflamasi, menghasilkan peningkatan respon imun dari tipe-Th1 terhadap antigen. 3-Odesasil-4’-monofosforil lipid A adalah serbuk liofilis atau cairan steril.
Persyaratan yang diberikan termasuk bagian garam trietilamin dari 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A juga berlaku untuk formulasi yang tidak berproses pada ruahan cair 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A.
PRODUKSI
KETENTUAN UMUM PRODUKSI
Metode produksi harus menunjukkan hasil 3-Odesasil-4’-monofosforil lipid A yang konsisten terhadap struktur dan fungsi dengan preparat 3-Odesasil-4’-monofosforil lipid A yang digunakan sebagai ajuvan pada vaksin tertentu yang terbukti memiliki efikasi dan keamanan klinis pada manusia. Selama studi pengembangan, dan jika revalidasi diperlukan, uji aktivitas residu endotoksin dilakukan dengan meyuntikkan secara intravena pada telur ayam berembrio berusia 12 hari sejumlah 0,1 mL enceran larutan uji (8 telur per pengenceran) 3-Odesasil-4’-monofosforil Lipid A. Telur dilapisi lilin dan dilihat mortalitas pada 18-24 jam setelah inokulasi dan hitung dosis letal 50% embrio ayam (CELD50). Aktivitas residu endotoksin dari 3-Odesasil-4’-monofosforil Lipid A dapat diterima jika CELD50 lebih dari 100µg.
Baku endotoksin dari Salmonella typhimurium disiapkan dan pengenceran yang terpilih disuntikkan pada setiap grup 8 telur.
Uji memenuhi syarat jika CELD50 baku endotoksin tidak lebih dari 0,05µg.
Pembuatan baku Satu bets 3-O-desasil-4’- monofosforil lipid A terbukti sebanding pada struktur dan fungsi dengan preparat 3-O-desasil-4’- monofosforil lipid A yang digunakan sebagai ajuvan pada vaksin tertentu yang terbukti memiliki efikasi dan keamanan klinis pada manusia.
LOT BENIH BAKTERI
Galur bakteri yang digunakan harus diidentifikasi sebagai galur yang sesuai dengan rekaman riwayat yang memuat informasi tentang asal galur dan uji karakteristik galur, terutama informasi fenotipe dan genotipe. Hanya lot benih yang memenuhi syarat yang dapat digunakan.
Identifikasi Lot benih kerja diidentifikasi menggunakan metode yang sesuai misalnya pewarnaan Gram dan profil asam lemak.
Kemurnian mikroba Setiap lot benih memenuhi syarat untuk tidak adanya organisme yang terkontaminasi. Kemurnian biakan bakteri diverifikasi dengan metode sensitivitas dan spesifisitas yang sesuai.
PROPAGASI DAN PANENAN
Bakteri dibiakkan dalam media cair yang sesuai. Pada akhir kultivasi, biakan diuji untuk kemurnian dan hasilnya. Media biakan dipisahkan dari massa bakteri dengan metode yang sesuai, seperti penyaringan. Hanya panenan yang konsisten terhadap profil laju pertumbuhan, pH, dan penggunaan O2 yang dapat digunakan untuk ekstraksi LPS.
GARAM TRIETILAMIN 3-O-DESASIL-4ʹMONOFOSFORIL LIPID A
LPS di ekstraksi dari sel bakteri dengan alkohol berturut-turut dan ekstraksi kloroform-metanol dan dikonversi menjadi 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A dengan hidrolisis, kemudian dimurnikan dan dijadikan bentuk garam dengan trietanolamin sebelum dibeku-keringkan. Garam trietilamin 3-Odesasil-4’-monofosforil lipid A beku kering harus memenuhi syarat.
Pemerian Deskripsi visual dari preparat tertentu setelah proses beku-kering ditetapkan dan disetujui oleh instansi yang berwenang; setiap bets garam trietilamin 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A beku kering harus memenuhi syarat.
Protein Kurang dari 0,5% b/b, tetapkan menggunakan metode yang sesuai, seperti Kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik untuk analisis asam amino seperti tertera pada Kromatografi <931>. Total kandungan asam amino dalam µg dihitung dengan membandingkan baku asam amino dan setara dengan kadar protein.
Asam Nukleat Tidak lebih dari 0,3% b/b, tetapkan menggunakan metode yang sesuai. Misalnya, metode fluorometri dapat digunakan dimana asam nukleat di ekstraksi dari garam trietilamin 3-Odesasil-4’-monofosforil lipid A beku kering, menggunakan larutan yang mengandung amonium hidroksida P dan detergen non-ionik yang sesuai, dan diwarnai dengan pewarna fluorescent yang tepat. Kadar asam nukleat pada zat uji diinterpolasi dari kurva kalibrasi.
Heksosamin <1407> Antara 1000 nmol/mg hingga 1450 nmol/mg
Fosfor <1401> Antara 0,5 µmol/mg hingga 0,8 µmol/mg.
Distribusi kongener Jumlah relatif dari kelompok kongener tetraasil, pentaasil, heksaasil, dan heptaasil ditetapkan dengan metode yang sesuai, misalnya Kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik seperti tertera pada Kromatografi <931>. Jumlah relatif dari setiap kelompok kongener dalam garam trietilamin 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A adalah:
Trietilamin 4,2 hingga 5,7 % b/b, tetapkan menggunakan metode yang sesuai, misalnya Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>
Air <1031> Tidak lebih dari 6,7% b/b.
Asam lemak bebas Tidak lebih dari 2,6% b/b, tetapkan menggunakan metode yang sesuai, misalnya Kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik seperti tertera pada Kromatografi <931>.
2-Keto-3-deoksioktonat Kurang dari 0,5% b/b, tetapkan menggunakan metode yang sesuai. Misalnya metode kolorimetri dapat digunakan dimana 2-keto-3-deoksioktonat dihasilkan melalui hidrolisis (asam sulfat 0,2 N pada 100° selama 30 menit), dioksidasi dengan Asam periodat P, dan direaksikan dengan Natrium arsenit P untuk menghasilkan asam β-formilpiruvat, yang selanjutnya digabungkan dengan asam tiobarbiturat untuk memberikan kromoform berwarna merah dengan panjang gelombang serapan maksimum pada 550 nm. Jumlah 2-keto-3-deoksioktonat diinterpolasi dari kurva kalibrasi.
Identifikasi Memenuhi syarat seperti yang diperoleh pada Distribusi Kongener
Kontaminasi bakteri Total mikroba aerobik: kriteria keberterimaan 101 koloni per unit per 10 mg. Lakukan penetapan seperti tertera pada Pengujian Mikrobiologi Sediaan Nonsteril: Uji Penghitungan Mikroba <52>.
Pirogen <231> Memenuhi syarat. Suntikkan 3 mL larutan yang mengandung 2,5 µg 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A per kg berat badan pada setiap kelinci.
RUAHAN CAIR 3-O-DESASIL-4ʹMONOFOSFORIL LIPID A
Garam trietilamin 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A didispersikan dalam larutan yang sesuai untuk tahapan proses selanjutnya pada konsentrasi target yang ditentukan. Jika garam tidak larut dalam air, mikrofluidisasi diperlukan untuk membuat suspensi cair yang stabil. Ruahan cair disterilisasi dengan penyaringan melalui penyaring retensi bakteri. Hanya ruahan cair 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A yang memenuhi syarat Identifikasi, Uji, Penetapan dan dalam batas yang disetujui untuk produk tertentu yang dapat digunakan untuk pembuatan 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A pada lot akhir.
PEMERIAN
Jika didispersikan dalam larutan berair: suspensi sedikit keruh. Jika dilarutkan dalam pelarut organik: deskripsi pemerian dibuat dan disetujui oleh instansi yang berwenang; ruahan cair 3-O-desasil-4’- monofosforil lipid A memenuhi syarat.
IDENTIFIKASI
Lakukan penetapan menggunakan Distribusi kongener seperti tertera pada Uji batas.
UJI BATAS
Bahan partikulat Ukuran partikel pada ruahan cair mikrofluidisasi ditetapkan dengan metode yang sesuai, seperti Spektrofotometri dan hamburan cahaya <1191>. Ukuran partikel setiap bets ruahan cair dalam batas yang disetujui untuk produk tertentu.
Sterilitas <71> Memenuhi syarat, lakukan penetapan menggunakan 10 mL untuk setiap media.
Distribusi kongener Jumlah relatif dari kelompok kongener tetraasil, pentaasil, heksaasil, dan heptaasil ditetapkan dengan metode yang sesuai, misalnya Kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik seperti tertera pada Kromatografi <931>. Jumlah relatif dari setiap kelompok kongener dalam 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A adalah:
PENETAPAN KADAR
Kandungan 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A ditetapkan dengan metode yang sesuai, misalnya Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931> ester metil asam lemak trifluorosetat anhidrat yang diderivatisasi dari 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A asam lemak asam dodekanoat (C12:0), asam tetradekanoat (C14:0), 3-hidroksi asam tetradekanoat (3-OH-C14:0) dan asam heksadekanoat (C16:0) yang diperoleh melalui hidrolisis 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A dalam larutan air/metanol (50:50 V/V), mengandung 5% natrium hidroksida. Untuk sampel uji, baku dan pengenceran kurva kalibrasi, asam pentadekanoat (C15:0) ditambahkan sebagai baku internal. Gradien suhu yang diterapkan harus memungkinkan pemisahan ester metil asam lemak dalam waktu sekitar 40 menit.
Hitung perbandingan antara respon puncak setiap ester metil asam lemak (C12:0, C14;0, 3-OH-C14:0 dan C16:0) dan respon puncak baku internal (perbandingan = respon puncak Cx/ respon puncak C15:0).
Jumlah 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A yang sesuai dengan nilai perbandingan pada kurva kalibrasi, yang dibuat dengan pengenceran baku 3- O-desasil-4’-monofosforil lipid A Kandungan 3-O-desasil-4’-monofosforil lipid A antara 80% hingga 120% dari kandungan yang diperkirakan.