PENGUJIAN MIKROBIOLOGI SEDIAAN NONSTERIL: UJI PENGHITUNGAN MIKROBA <52>

PENDAHULUAN

Bab ini menjelaskan tentang pengujian kuantitatif untuk bakteri mesofil dan kapang khamir yang dapat tumbuh pada kondisi aerob.
Pengujian ini dirancang untuk menentukan apakah suatu bahan atau sediaan memenuhi spesifikasi mutu secara mikrobiologi yang telah ditetapkan. Untuk pelaksanaan pengujian, ikuti petunjuk di bawah ini, termasuk jumlah sampel dan interpretasi hasil uji.
Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk sediaan yang mengandung mikroba viabel sebagai bahan aktif.
Prosedur mikrobiologi alternatif termasuk metode otomatisasi dapat digunakan setelah dibuktikan kesetaraannya dengan metode farmakope.

PROSEDUR UMUM

Pengujian dilakukan pada kondisi aseptik sebagai tindakan pencegahan untuk menghindari kontaminasi mikroba luar terhadap sediaan, tetapi tidak mempengaruhi mikroba yang diuji.
Jika sediaan yang akan diuji memiliki aktivitas antimikroba, sifat antimikroba dihilangkan atau dinetralkan sebelum diuji. Jika digunakan inaktivator, harus dibuktikan efikasi dan tidak toksik terhadap mikroba.
Jika dalam penyiapan sampel digunakan surfaktan, harus dibuktikan surfaktan tidak toksik terhadap mikroba dan kompatibel dengan inaktivator yang digunakan.
METODE PENGHITUNGAN
Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin (APM) yang secara umum kurang akurat untuk penghitungan mikroba, namun sesuai untuk produk dengan tingkat kontaminasi rendah.
Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa faktor antara lain jenis produk yang diuji, batas mikroba yang dipersyaratkan, dan ukuran sampel yang memadai untuk memperkirakan kesesuaian dengan spesifikasi. Kesesuaian metode terpilih harus ditetapkan. 

UJI FERTILITAS, KESESUAIAN METODE PENGHITUNGAN DAN KONTROL NEGATIF

Ketentuan Umum

Kemampuan metode untuk mendeteksi mikroba pada sediaan yang diuji harus ditetapkan.
Jika terjadi perubahan kinerja pengujian atau perubahan sediaan yang mempengaruhi hasil uji, maka harus dilakukan kesesuaian terhadap metode.

Penyiapan Galur Mikroba Uji

Gunakan suspensi mikroba uji yang stabil, terstandar atau siapkan seperti yang tertera di bawah ini. Galur mikroba uji dipelihara dengan teknik biakan lot benihhingga mikroba yang digunakan untuk inokulasitidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli. Biakkan tiap galur bakteri dan kapang khamir uji secara terpisah seperti tertera pada Tabel 1.

Tabel 1. Penyiapan dan Penggunaan Mikroba Uji

Untuk membuat suspensi mikroba uji gunakan LarutanDapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0 atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2; untuk mempertahankan spora Aspergillus brasiliensis, tambahkan polisorbat 80 P 0,05%pada dapar. Gunakan suspensi dalam waktu 2 jam, atau 24 jam jika disimpan pada 2º - 8º. Sebagai alternatif penyiapan dan pengenceran suspensi segar sel vegetatif A. brasiliensis atau B. subtilis, dapat digunakan suspensi spora yang stabil dengan volume yang sesuai untuk inokulasi. Suspensi spora yang stabil dipertahankan pada 2º – 8º untuk jangka waktu yang tervalidasi.

Kontrol Negatif

Untuk membuktikan kesesuaian kondisi pengujian, dilakukan kontrol negatif menggunakan pelarut yang sesuai seperti pada penyiapan larutan uji. Kontrol negatif harus menunjukkan tidak ada pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan pada saat pengujian seperti tertera pada Pengujian Sediaan. Apabila terjadi kegagalan pada kontrol negatif diperlukan investigasi.

Fertilitas Media

Uji setiap bets media siap pakai dan setiap bets media yang dibuat dari media kering atau dari komponen yang tertera pada formula. Inokulasi secara terpisah sejumlah mikroba (tidak lebih dari 100 koloni) ke dalam lempeng media Soybean-Casein Digest Broth, Soybean-Casein Digest Agar dan Sabouraud Dextrose Agar seperti tertera pada Tabel 1. Inkubasi sesuai dengan kondisi yang tertera pada Tabel 1.
Untuk media padat, pertumbuhan yang diperoleh tidak boleh berbeda lebih dari faktor dua dari nilai hitung inokulum standar. Contoh jika inokulum standar yang digunakan adalah 100 CFU maka nilai hitung yang diterima adalah 100 CFU/2 = 50 sampai 100 x 2 = 200 CFU. Pertumbuhan mikroba dan hasil uji fertilitas pada inokulum yang dibuat segar harus sebanding dengan bets sebelumnya. Media cair dapat digunakan jika pertumbuhan mikroba uji terlihat jelas dan sebanding dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba dalam Sediaan

PENYIAPAN SAMPEL
Metode penyiapan sampel disesuaikan dengan sifat fisik sediaan yang diuji. Jika dengan prosedur yang diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan maka harus dikembangkan prosedur lain yang sesuai.

Sediaan Larut Air Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth, bila perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan lebih lanjut dengan pelarut yang sama.

Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam Air Suspensikan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth. Dapat ditambahkan surfaktan seperti polisorbat 80P 1 g per L untuk membantu mensuspensikan bahan yang sulit dibasahi, jika perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan lebih lanjut dengan pelarut yang sama.

Sediaan Berlemak Larutkan sediaan yang akan diuji dalam isopropil miristat yang disterilkan dengan cara penyaringan, atau campurkan sediaan yang akan diuji dengan sesedikit mungkin polisorbat 80 steril atau surfaktan non-inhibitor lain steril, jika perlu hangatkan dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 40º atau pada kasus tertentu tidak lebih dari 45º. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air. Tambahkan secukupnya pengencer yang telah dihangatkan hingga diperoleh pengenceran 1 dalam 10. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dengan waktu sesingkat mungkin untuk pembentukan emulsi. Lakukan pengenceran bertingkat dengan pengencer yang mengandung polisorbat 80 atau surfaktan non-inhibitor lain sterildengan kadar sesuai.

Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol Pindahkan seluruh isi sediaan secara aseptik ke dalam penyaring membran atau wadah steril yangsesuai untuk pengambilan sampel. Gunakan seluruh isi atau sejumlah tertentu sediaan dari tiap wadah yang diuji.

“Transdermal Patches” Lepaskan lapisan pelindung, letakkan bagian berperekat menghadap ke atas pada lempeng kaca atau baki plastik steril. Agar tidak saling menempel, tutup permukaan berperekat dengan bahan berpori steril yang sesuai (misal kasa steril), kemudian pindahkan lembaran transdermal dalam wadah berisi pengencer yang mengandung inaktivator seperti polisorbat 80 dan/atau lesitin dengan volume yang sesuai. Kocok kuat selama tidak kurang dari 30 menit.

INOKULASI DAN PENGENCERAN
Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan kontrol (pengencer tanpa sampel) seperti yang tertera diatas, untuk mendapatkan inokulum dengan jumlah tidak lebih dari 100 koloni. Volume suspensi inokulum yang ditambahkan tidak lebih dari 1% dari volume sediaan yang diencerkan.
Untuk menunjukkan perolehan kembali mikroba uji yang dapat diterima dari sediaan, gunakan sampel dengan faktor pengenceran terendah yang memungkinkan. Jika tidak memungkinkan karena terdapat aktivitas antimikroba atau kelarutan yang rendah, perlu dikembangkan protokol uji yang sesuai. Jika penghambatan pertumbuhan mikroba dari sampel tidak dapat dihindari, alikuot suspensi mikroba dapat ditambahkan setelah proses netralisasi, pengenceran atau penyaringan. 

NETRALISASI/PENGHILANGAN
AKTIVITAS ANTIMIKROBA
Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel yang disiapkan seperti tertera pada Inokulasi dan Pengenceran, dan diinkubasi mengikuti prosedur yang tertera pada Perolehan kembali mikroba uji dalam sediaan, dibandingkan dengan jumlah perolehan kembali mikroba uji dari kontrol.
Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor reduksi lebih besar dari 2), harus dilakukan modifikasi prosedur uji penghitungan untuk memastikan validitas hasil. Modifikasi prosedur dapat dilakukan dengan:

1. Penambahan jumlah volume pengencer atau media biakan;
2. Penambahan larutan penetral khusus atau umum pada pengencer;
3. Penyaringan membran; atau
4. Kombinasi perubahan di atas.

Zat Penetral Zat penetral digunakan untuk menetralkan aktivitas senyawa antimikroba (seperti yang tertera pada Tabel 2). Zat tersebut dapat ditambahkan pada pelarut atau media yang sesuai sebelum disterilkan. Zat penetral yang digunakan harus menunjukkan efikasi dan tidak toksik terhadap mikroba yang dibuktikan dengan penambahan zat penetral pada blangko tanpa sediaan.

Tabel 2. Zat Penetral/Metode Umum untuk Zat Penghambat

Jika tidak ditemukan metode netralisasi yang sesuai, dapat diartikan bahwa kegagalan isolasi mikroba yang diinokulasikan disebabkan oleh aktivitas antimikroba dari sediaan. Hal ini menunjukkan bahwa sediaan tidak mungkin terkontaminasi spesies mikroba uji yang digunakan. Lakukan pengujian dengan faktor pengenceran tertinggi yang sesuai dengan pertumbuhan mikroba uji dan kriteria keberterimaan khusus. Sebagai informasi, produk mungkin dapat menghambat spesies mikroba spesifik tertentu seperti tertera pada Tabel 1, namun tidak dapat menghambat galur mikroba lainnya. 

PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI DALAM SEDIAAN
Untuk tiap mikroba yang tercantum seperti tertera pada Tabel 1, lakukan uji terpisah. Hanya mikroba dari galur uji yang ditambahkan yang dihitung.

Penyaringan Membran Gunakan penyaring membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 μm. Jenis bahan penyaring dipilih sedemikian rupa sehingga kemampuan menahan bakteri tidak dipengaruhi oleh kandungan sampel uji. Gunakan satu membran penyaring untuk tiap mikroba uji.
Pindahkan sejumlah sampel yang sesuai yang disiapkan seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktivitas Antimikroba (setara 1 g sediaan, atau kurang dari 1 g jika diperkirakan jumlah koloni besar) ke dalam penyaring membran, saring segera dan bilas penyaring membran dengan sejumlah tertentu volume pengencer.
Untuk menentukan Angka Lempeng Total (ALT) mikroba aerob, pindahkan penyaring membran ke permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest Agar (SCDA). Untuk menentukan Angka Kapang Khamir (AKK), pindahkan membran ke permukaan lempeng media Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi seperti tertera pada Tabel 1. Lakukan pengamatan dan penghitungan.

Metode Angka Lempeng Total Metode angka lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap media, dan hasil merupakan rata-rata hitung jumlah koloni.
Metode TuangUntuk cawan Petri berdiameter 9 cm, tambahkan 1 mL sampel yang disiapkan seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi /Penghilangan Aktivitas Antimikroba ke dalam tiap cawan dan kemudian tambahkan 15 - 20 mL Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu tidak lebih dari 45°. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang tertera pada Tabel 1.
Inkubasi seperti tertera pada Tabel 1. Hitung jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media dan hitung jumlah koloni inokulum awal.
Metode SebarUntuk cawan Petri berdiameter 9 cm, tambahkan 15-20 mL Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu lebih kurang 45° pada tiap cawan Petri, dan biarkan memadat. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media. Keringkan lempeng media dalam laminar air flow atau dalam inkubator. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang tertera pada Tabel 1. Inokulasikan 0,1 mL sampel yang disiapkan seperti pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktivitas Antimikroba dengan menyebarkan pada permukaan lempeng media. Inkubasi dan hitung jumlah koloni seperti yang telah dijelaskan pada Metode Tuang.

Metode Angka Paling Mungkin (APM) Metode APM kurang presisi dan akurat dibandingkan dengan Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng Total. Hasilnya tidak dapat diandalkan terutama untuk penghitungan kapang. Metode APM dapat digunakan untuk menghitung ALT jika tidak ada metode lain yang. Jika metode APM telah ditetapkan, lakukan pengujian seperti dibawah ini.

Siapkan minimal tiga seri pengenceran (10-1, 10-2, 10-3) sediaan dengan cara seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktivitas Antimikroba. Dari tiap tingkat pengenceran sediaan, inokulasikan masing-masing tiga alikot 1 g atau 1 mL ke dalam tiga seri tabung berisi 9 – 10 mL media Soybean-Casein Digest Broth. Jika perlu tambahkan surfaktan seperti polisorbat 80 atau inaktivator senyawa antimikroba ke dalam media. Jika dibuat tiga tingkat pengenceran, maka diperoleh 9 tabung terinokulasi.
Inkubasi semua tabung yang telah diinokulasi pada suhu 30° - 35° selama tidak lebih dari 3 hari. Jika terdapat kesulitan dalam membaca hasil, atau ketidakyakinan terhadap sifat dari sediaan yang diuji, lakukan sub-kultur pada media Broth yang sama atau Soybean Casein Digestic Agar selama 1 sampai 2 hari pada suhu yang sama, gunakan hasil ini. Dengan menggunakan Tabel 3 dapat ditentukan angka paling mungkin (APM) per g atau per mL sediaan uji.

Tabel 3. Nilai Angka Paling Mungkin Mikroba

HASIL DAN INTERPRETASI

Dalam memverifikasi kesesuaian Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng Total, perbedaan jumlah rata-rata dari tiap mikroba uji tidak lebih besar dari dua kali nilai kontrol tanpa sediaan seperti tertera pada Inokulasi dan Pengenceran. Dalam memverifikasi kesesuaian Metode APM, nilai yang dihitung dari inokulum harus dalam batas kepercayaan 95% dari nilai kontrol.
Jika kriteria tersebut di atas tidak dapat dipenuhi untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan metode tersebut diatas, maka digunakan metode dan kondisi uji yang paling mendekati kriteria untuk menguji sediaan.

PENGUJIAN SEDIAAN
Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian

Jika tidak dinyatakan lain, gunakan 10 g atau 10 mL sediaan uji yang disiapkan dengan cara seperti di atas. Untuk sediaan cairan atau padatan dalam bentuk aerosol, gunakan 10 wadah sampel, demikian juga untuk sampel “transdermal patches”.
Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan dengan bahan aktif yang dibuat dalam jumlah per unit dosis (contoh tablet, kapsul, injeksi) kurang dari atau sama dengan 1 mg, atau jumlah per g atau per mL (untuk sediaan tidak dalam unit dosis) kurang dari 1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang diuji tidak kurang dari jumlah dalam 10 unit dosis atau 10 g atau 10 mL sediaan.
Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari 1000 mL atau 1000 g), jumlah sampel yang diuji harus 1% dari bets kecuali ditetapkan jumlah sampel yang lebih kecil dan disetujui.
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang dari 200 unit (misal sampel untuk uji klinis), ukuran sampel dapat dikurangi menjadi dua unit, atau satu unit jika kurang dari 100 unit.
Ambil sampel secara acak dari ruahan sediaan atau dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan sejumlah isi wadah hingga mencapai jumlah sampel yang cukup.

Pemeriksaan Sediaan

PENYARINGAN MEMBRAN
Gunakan alat penyaring yang dirancang sedemikian rupa sehingga memungkinkan pemindahan penyaring membran ke media. Siapkan sampel menggunakan metode seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan, masukkan sejumlah tertentu sampel ke dalam dua penyaring membran, saring segera. Bilas tiap penyaring sesuai dengan prosedur. Untuk menentukan Angka Lempeng Total (ALT) mikroba aerob, pindahkan satu penyaring membran ke permukaan Soybean-Casein Digestic Agar, dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 3 – 5 hari. Untuk menentukan Angka Kapang Khamir (AKK), pindahkan satu penyaring membran yang lain ke permukaan Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada suhu 20° - 25° selama 5-7 hari. Hitung jumlah koloni per g atau per mL sediaan.
Untuk pengujian sampel “transdermal patches”, secara terpisah saring 10% dari volume larutan seperti yang tertera pada Penyiapan Sampel menggunakan masing-masing dari dua penyaring membran steril. Pindahkan satu membran pada Soybean-Casein Digest Agar untuk ALT dan membran lainnya pada Sabouraud Dextrose Agar untuk AKK.

METODE ANGKA LEMPENG TOTAL
Metode Tuang Siapkan sampel menggunakan metode yang sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan untuk masing-masing media sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap tingkat pengenceran. Inkubasi lempeng Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 – 5 hari dan lempeng Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama 5-7 hari. Pilih cawan dari satu tingkat pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi kurang dari 250 untuk ALT dan 50 untuk AKK. Hitung jumlah rata-rata koloni dalam media biakan dan jumlah koloni per g atau per mL sediaan.

Metode Sebar Siapkan sampel dengan metode yang sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap media dan tiap tingkat pengenceran. Untuk inkubasi dan penghitungan jumlah koloni, lakukan seperti yang tertera pada Metode Tuang.
METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM)
Siapkan dan encerkan sampel dengan metode sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Inkubasi semua tabung selama 3-5 hari pada suhu 30°-35°. Jika perlu, lakukan subkultur menggunakan metode yang sesuai. Catat jumlah tabung yang menunjukkan pertumbuhan mikroba pada tiap tingkat pengenceran. Tentukan APM mikroba per g atau per mL sediaan yang diuji berdasarkan Tabel3.

Interpretasi Hasil

Angka Lempeng Total (ALT) mikroba aerob dianggap sama dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Soybean-Casein Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan pada media ini, maka dihitung sebagai bagian dari ALT. Angka Kapang dan Khamir (AKK) dianggap sama dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Sabouraud Dextrose Agar; jika koloni bakteri ditemukan pada media ini, maka dihitung sebagai bagian dari AKK. Jika AKK diperkirakan melebihi kriteria keberterimaan karena adanya pertumbuhan bakteri, dapat digunakan Sabouraud Dextrose Agar yang mengandung antibiotik. Jika penghitungan dilakukan menggunakan metode APM, nilai penghitungan yang diperoleh merupakan Angka Lempeng Total (ALT) mikroba aerob.
Jika telah ditetapkan kriteria keberterimaan untuk mutu mikrobiologi, maka diinterpretasikan sebagai berikut:
- 101 koloni: maksimum penghitungan yang dapat diterima = 20;
- 102 koloni: maksimum penghitungan yang dapat diterima = 200;
- 103 koloni: maksimum penghitungan yang dapat diterima = 2000; dan seterusnya.
Larutan dan media yang direkomendasikan tertera pada Pengujian Mikrobiologi Sediaan Nonsteril: Uji Mikroba Spesifik <53>.