UJI PADA VAKSIN: SUBSTRAT SEL UNTUK PRODUKSI VAKSIN MANUSIA <1412>

Bab umum ini membahas lini sel diploid dan lini sel lestari yang digunakan sebagai sel substrat untuk produksi vaksin untuk penggunaan manusia; informasi spesifik terkait vaksin yang dibuat melalui teknologi DNA rekombinan tercantum pada Produk monografi teknologi DNA rekombinan. Pengujian akan dilakukan pada berbagai tahap (benih sel, sel induk / master cell bank (MCB), Bank sel kerja / working cell bank (WCB), Sel Akhir Produksi / End of production cells (EOPC) atau Bank Sel Ekstensi / Extended cell bank (ECB) Bank Sel Ekstensi / Extended cell bank (ECB) yang sesuai dengan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang digunakan untuk produksi) sesuai Tabel 1 Ketentuan umum untuk penggunaan lini sel dan metode pengujian dijelaskan di bawah ini. Jika sel atau sel primer yang telah mengalami beberapa pasase tidak mengikuti ketentuan bank sel digunakan untuk produksi vaksin, persyaratan terdapat dalam masing-masing monografi.

Lini sel diploid Lini sel diploid memiliki kemampuan pasase tinggi tetapi terbatas untuk propagasi secara in vitro.

Lini sel lestari Lini sel lestari memiliki kapasitas untuk propagasi tanpa batas waktu secara in vitro; sel sering memiliki perbedaan kariotipe dibandingkan dengan sel asli; sel dapat diperoleh dari jaringan yang sehat atau jaringan tumor, baik dari mamalia atau dari serangga. 

Secara teori terdapat risiko penggunaan lini sel lestari, terutama jika potensi tumor telah terbukti secara eksperimental. Risiko ini terkait dengan aktivitas biologi residu DNA sel inang dalam vaksin. Residu DNA sel inang dapat dikaitkan dengan risiko infektivitas jika genom virus DNA atau provirus terdapat dalam DNA seluler (kromosom terintegrasi atau ekstra kromosom). Selain itu, terdapat risiko potensial onkogenisitas jika sel substrat berpotensi tumor.

Vaksin yang diproduksi menggunakan lini sel lestari, untuk mengetahui muncul atau tidaknya tumorigenik, harus dilakukan analisis dan mitigasi risiko untuk menentukan kriteria keberterimaan DNA sel inang residu dalam produk akhir serta mengevaluasi konsistensi protein sel inang.

Sistem bank sel Produksi vaksin dalam lini sel diploid atau sel lestari didasarkan pada sistem bank sel. Umur in vitro sel dihitung dari bank sel induk. Setiap WCB disiapkan dari satu atau lebih wadah MCB. Penggunaan, identitas, dan kontrol bank sel harus didokumentasikan dengan baik.

Media dan bahan yang berasal dari manusia atau hewan Komposisi media yang digunakan untuk isolasi dan semua kultur berikutnya dicatat secara terperinci, dan jika bahan asal manusia atau hewan digunakan, harus bebas dari agens asing dalam vaksin virus <72> dan harus memenuhi Keamanan virus 

Jika larutan albumin manusia digunakan harus memenuhi persyaratan yang tertera pada Larutan Albumin Manusia.

Jika serum sapi digunakan, harus memenuhi persyaratan yang tertera pada Serum Sapi. Tripsin yang digunakan untuk pembuatan kultur sel diuji dengan metode yang sesuai dan terbukti steril serta bebas mikoplasma dan virus, kecuali yang berasal dari produk rekombinan.

Benih sel Data asal sel, histori dan karakterisasi digunakan untuk menilai kesesuaian benih sel.

Sumber benih sel Untuk lini sel manusia, informasi berikut terkait donor harus didokumentasikan: asal etnis dan geografis; usia; jenis kelamin; kondisi fisiologis umum; jaringan atau organ yang digunakan; hasil semua uji patogen.

Untuk lini sel hewan, informasi berikut terkait sumber sel didokumentasikan: spesies; galur; kondisi pembiakan hewan; asal geografis; umur; jenis kelamin; kondisi fisiologis umum, jaringan atau organ yang digunakan; hasil semua uji patogen. Sel yang berasal dari sel saraf, seperti neuroblastoma dan lini sel P12 tidak digunakan untuk produksi vaksin karena mengandung agens ensefalopati spongiform.

Histori benih sel Informasi berikut didokumentasikan: metode yang digunakan untuk mengisolasi benih sel; metode kultur; prosedur lain yang digunakan untuk membuat MCB, terutama yang mungkin mencemari sel dari agens asing. Informasi lengkap mungkin tidak tersedia pada komposisi media yang digunakan sebelumnya untuk kultivasi sel, misalnya pada sumber bahan hewan; Jika disetujui oleh otoritas obat terkait, bank sel yang sudah mapan menggunakan media tersebut dapat digunakan untuk produksi vaksin

Tabel 1 – Pengujian lini sel

1. Karakter diploid dibuat untuk setiap WCB tetapi menggunakan sel sesuai dengan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang digunakan untuk produksi 
2. Jika sel rentan terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis atau spesies lain 
3. Jika digunakan sel serangga atau tanaman
4. Pengujian dilakukan untuk MCB, tetapi menggunakan sel sesuai dengan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang digunakan untuk produksi. 
5. Pengujian dilakukan untuk WCB, tetapi menggunakan sel sesuai dengan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang digunakan untuk produksi. 
6. Uji spesifik untuk kemungkinan kontaminan (mis. virus) ditentukan menurut analisis risiko berdasarkan asal sel dan bahan asing yang potensial yang secara tidak sengaja terpapar selama proses produksi atau melalui penggunaan bahan hewan atau tanaman. Tahap pengujian yang sesuai harus dipilih berdasarkan analisis risiko. 
7. Metode ini dapat digunakan sebagai alternatif untuk uji in vivo dan teknik amplifikasi asam nukleat spesifik atau sebagai pelengkap atau alternatif untuk tes kultur in vitro berdasarkan analisis risiko dan sesuai dengan instansi yang kompeten. Tahap pengujian yang dipilih didasarkan pada analisis risiko.
8. Lini sel MRC-5, WI-38 dan FRhL-2 dinyatakan tidak berpotensi tumor dan tidak perlu diuji. Uji tidak dilakukan pada lini sel yang diketahui berpotensi tumor, misalnya CHO dan BHK-21. Pengujian dilakukan pada benih sel, tetapi menggunakan sel sesuai dengan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang digunakan untuk produks

Karakterisasi benih sel Harus diperiksa sifat berikut ini: 

1. Identitas sel, menggunakan metode seperti analisis isoenzim, uji imunokimia in vitro, sidik jari asam nukleat dan teknik amplifikasi asam nukleat (NAT); 
2. Karakteristik pertumbuhan sel dan sifat morfologisnya (mikroskopi optik dan elektron); 
3. Lini sel diploid, karyotipe; 
4. Lini sel diploid, masa hidup in vitro dalam hal level penggandaan populasi.

Stabilitas substrat sel Viabilitas sel dalam penyimpanan yang sesuai harus dilakukan. Untuk produk tertentu yang dibuat dalam lini sel, perlu ditunjukkan bahwa produksi yang konsisten dapat diperoleh pada pasase dan/atau level penggandaan populasi pada awal dan akhir periode penggunaan yang dimaksud.

Agens asing infektif Lini sel untuk produksi vaksin, harus dilakukan pengujian terhadap bahan asing yang menular berdasarkan analisis risiko. Asal sel substrat serta agens asing potensial yang dapat secara tidak sengaja terdeteksi selama proses produksi atau melalui penggunaan bahan turunan hewan atau tumbuhan harus dipertimbangkan dalam pemilihan sel permisif yang sesuai. Salah satu uji tercantum pada Tabel 1, tetapi uji alternatif dapat fokus pada pengujian yang lebih lengkap di tingkat MCB atau WCB. Dalam setiap pengujian, harus dilakukan justifikasi untuk menjamin tingkat keamanan yang sama seperti yang diuraikan dalam Tabel 1. Teknik molekuler sensitif dengan kemampuan deteksi luas diantaranya metode “massive parallel sequencing” (MPS), “polymerase chain reaction” (PCR) untuk seluruh famili virus atau “random-priming methods” (dengan atau tidak dengan sekuensing), hibridisasi terhadap susunan oligonukleotida dan spektrometri massa. Metode ini dapat digunakan sebagai alternatif untuk uji in vivo atau uji NAT spesifik atau sebagai metode tambahan/alternatif untuk uji kultur in vitro, sesuai dengan persetujuan instansi yang berwenang. Kemampuan proses untuk menghilangkan/menginaktivasi virus spesifik harus mempertimbangkan asal dan sejarah kultur lini sel dan virus asing yang diketahui menginfeksi spesies asal, misalnya, virus simian 40 pada kera rhesus, virus Flock house pada sel serangga, atau virus yang secara tidak sengaja terdeteksi selama proses produksi atau melalui penggunaan bahan asal hewan atau tumbuhan. Untuk lini sel asal serangga, dilakukan uji virus spesifik yang relevan dengan spesies asal sel serangga dan arbovirus (virus yang ditularkan melalui arthropoda). Panel virus yang diuji dipilih sesuai dengan kondisi pengetahuan ilmiah saat ini. Uji transkriptase balik tidak diperlukan untuk lini sel yang mengekspresikan partikel retroviral endogen (misal. sel hewan pengerat) karena hasil uji diharapkan positif, dan dengan demikian uji infektivitas harus dilakukan untuk menentukan apakah partikel retroviral endogen ini infektif atau tidak.

Lini sel yang menunjukkan retrovirus infektif, tidak dapat digunakan untuk produksi vaksin, kecuali dinyatakan lain.

Tumorigenisitas

Tumorigenisitas didefinisikan sebagai kemampuan lini sel untuk menginduksi tumor setelah penyuntikan sel hidup utuh pada hewan imunodefisiensi atau imunosupresi (biasanya hewan pengerat). Uji tumorigenisitas dilakukan menggunakan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang akan digunakan untuk produksi vaksin.

Lini sel yang diketahui bersifat non-tumorigenik (MRC-5, WI-38 dan FRhL-2) dan sel yang bersifat tumorigenik (sel CHO) tidak perlu dilakukan pengujian dan dokumentasi lebih lanjut.

Jika lini sel yang sebelumnya belum pernah dikarakterisasi adalah tumorigenik, studi onkogenisitas harus dilakukan menggunakan DNA yang dimurnikan dari lisat lini sel dan / atau lini sel untuk menunjukkan bebas komponen onkogenik. Hasilnya digunakan sebagai bagian dari analisis risiko yang dilakukan untuk mendukung penggunaan lini sel untuk produksi vaksin. Penentuan TPD50 (Dosis yang menghasilkan tumor pada 50% hewan uji) dan kapasitas untuk membentuk metastasis adalah sifat khas yang harus ditentukan sebagai bagian dari analisis risiko.

Meskipun terdapat kesulitan dalam menunjukkan korelasi yang baik dan konklusif dengan fenotip tumorigenik, uji karakterisasi in vitro tambahan dapat dilakukan untuk mendokumentasikan sifat sel substrat lainnya, seperti kemampuan menginduksi pertumbuhan sel invasif dalam otot dan/atau kemampuan sel substrat untuk menginduksi transformasi sel 3T3.

Residu DNA Sel Inang

Setiap vaksin yang diproduksi menggunakan lini sel, kandungan residu DNA sel inang pada produk akhir harus diuji dan ditentukan batas maksimal yang dapat diterima berdasarkan analisis risiko, dengan mempertimbangkan:

1. Sifat sel substrat (non-tumorigenik, level tumorigenisitas) dan sumber asalnya (manusia/non-manusia); 
2. Keberadaan senyawa kimia seperti betapropiolakton dan/atau penggunaan DNase untuk menginaktivasi aktivitas biologis yang potensial (onkogenisitas, infektivitas) dari residu DNA sel inang; 
3. Kemampuan proses untuk mengurangi jumlah dan ukuran residu DNA sel inang yang mencemari; 
4. Tujuan penggunaan vaksin (contoh: rute pemberian); 
5. Metode yang digunakan untuk mengukur residu DNA sel inang.

Secara umum, proses purifikasi vaksin parenteral dapat mengurangi residu DNA sel inang dalam produk akhir hingga kurang dari 10 ng per dosis, namun kriteria keberterimaan harus disetujui oleh instansi yang berwenang.

Jika studi validasi (contoh: spiking studies menggunakan distribusi ukuran DNA yang sesuai) telah dilakukan dan reprodusibilitas proses produksi dalam mengurangi DNA sel inang residu hingga tingkat yang diharapkan terbukti, uji DNA sel inang residu dapat dihilangkan dengan persetujuan dari instansi yang berwenang.

Karakterisasi kromosom Lini sel diploid menunjukkan karakteristik diploid. Karakterisasi lini sel diploid yang lebih lengkap dengan analisis karyotipe diperlukan jika penghilangan sel utuh selama proses setelah panen belum tervalidasi. Sampel dari 4 pasase yang masing-masing pasase berjarak sama dan melebihi masa hidup lini sel harus diuji. Tidak kurang dari 200 sel pada fase metafase diuji jumlah kromosom yang tepat dan untuk frekuensi hiperploidi, hipoploidi, poliploidi, kerusakan, dan abnormalitas struktural.

Lini sel MRC-5, WI-38, dan FRhL-2 diketahui bersifat diploid dan terkarakterisasi dengan baik. Jika ketiganya tidak dimodifikasi secara genetik, karakterisasi lebih lanjut tidak perlu dilakukan.

METODE UJI UNTUK BIAKAN SEL

Morfologi Morfologi sel dideskripsikan dan didokumentasikan dengan baik.

Identifikasi Analisis sidik jari asam nukleat dan beberapa pilihan metode yang relevan untuk menentukan identitas sel: 

1. karakteristik biokimia (analisis isoenzim); 
2. karakteristik imunologis (histokompatibilitas antigen, uji imunokimia in vitro); 
3. penanda sitogenetik; 
4. teknik amplifikasi asam nukleat.

Sel kontaminan Analisis sidik jari asam nukleat dilakukan untuk identifikasi, dan juga untuk melihat apakah bebas dari sel kontaminan.

Kontaminasi bakteri dan jamur MCB dan WCB memenuhi syarat uji sterilitas<71>. Gunakan 10 mL beningan dari biakan sel untuk setiap media. Lakukan pengujian pada 1% wadah, dengan minimum 2 wadah.

Mikobakteria <73> Jika sel rentan terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis atau spesies lain, MCB atau WCB harus memenuhi syarat untuk Uji Keberadaan Mikobakteria <73>. Teknik Amplifikasi Asam Nukleat <1389> dapat digunakan sebagai metode alternatif jika telah divalidasi dan dapat dibandingkan dengan metode kultur.

Mikoplasma <74> MCB dab WCB memenuhi syarat. Gunakan satu atau lebih wadah.

Spiroplasma Spiroplasma dapat masuk ke dalam sel substrat melalui kontaminasi bahan yang berasal dari tanaman atau lini sel serangga. MCB dan WCB harus bebas dari spiroplasma yang diuji menggunakan metode tervalidasi yang disetujui oleh instansi yang berwenang. Metode Teknik Amplifikasi Asam Nukleat <1389> untuk deteksi mikoplasma dapat digunakan untuk mendeteksi spiroplasma setelah divalidasi dan disetujui oleh instansi yang berwenang. Gunakan satu atau lebih wadah untuk pengujian.

Mikroskopi elektron MCB diamati menggunakan mikroskop elektron untuk melihat agens asing. Lini sel dipelihara pada suhu yang secara rutin digunakan untuk produksi dan diambil pada atau melebihi tingkat penggandaan populasi maksimum. Sebagai tambahan, lini sel serangga dipelihara pada suhu di atas atau di bawah suhu yang secara rutin digunakan untuk produksi dan juga untuk perlakuan lain seperti paparan terhadap bahan kimia. Untuk lini sel serangga, suhu pemeliharaan dan perlakuan yang digunakan harus disetujui oleh instansi yang berwenang, beserta dengan jumlah sel yang akan diamati.

Uji agens asing dalam biakan sel Sel mamalia, sel hidup (setidaknya 107 sel) atau lisat sel yang setara, dalam beningan biakannya, diko-kultivasi (untuk sel hidup) atau diinokulasi (untuk lisat sel) pada biakan: 

1. Sel diploid manusia 
2. Sel ginjal simian kontinu 
3. Substrat sel selain sel manusia atau simian, berasal dari bets terpisah.

Pada lini sel serangga, lisat sel diinokulasi pada biakan sel lapis tunggal dari sel lain, termasuk manusia, simian, dan sebagai tambahan, setidaknya satu lini sel yang berbeda dari yang digunakan dalam produksi, yang sesuai untuk virus serangga dan dapat mendeteksi arbovirus manusia (contoh: sel BHK-21).

Hasil ko-kultivasi biakan sel (untuk sel hidup) atau inokulasi biakan sel (untuk lisat sel) diamati efek sitopatik selama tidak kurang dari 2 minggu. Jika lini sel diketahui mampu menumbuhkan sitomegalovirus manusia ataupun simian, biakan sel diploid manusia diamati selama tidak kurang dari 4 minggu. Biakan sel diploid manusia yang diperpanjang selama 4 minggu untuk tujuan mendeteksi sitomegalovirus manusia atau simian, dapat digantikan dengan metode Teknik Amplifikasi Asam Nukleat<1389>. Untuk menjaga biakan sel tetap sehat selama tambahan waktu 2 minggu, perlu diberikan medium segar atau lakukan subkultur setelah 2 minggu ke dalam biakan segar agar dapat mendeteksi virus. Pada akhir periode pengamatan, lakukan uji hemaglutinasi pada beningan biakan atau pada sel hidup untuk haemadsorbingvirus menggunakan sel darah merah marmot. Jika sel darah merah marmot disimpan, simpan pada suhu 5° ± 3° selama tidak lebih dari 7 hari. Lakukan analisis terhadap setengah dari biakan setelah inkubasi pada 5° ± 3° selama 30 menit dan setengah bagian lainnya setelah inkubasi pada 20° - 25° selama 30 menit. Uji haemaglutinasi tidak dapat digunakan untuk arbovirus.

Uji dinyatakan valid jika tidak kurang dari 80% biakan sel tetap hidup. Sel substrat memenuhi syarat pengujian jika tidak ditemukan adanya agens asing.

Retrovirus Jika lini sel belum diketahui menghasilkan partikel retroviral, periksa keberadaan retrovirus menggunakan:

1. “Product-enhanced reverse transcriptase” (PERT) assay seperti tertera pada uji Teknik Amplifikasi Asam Nukleat <1389> dilakukan terhadap beningan bank sel menggunakan sel pada atau melebihi level penggandaan populasi maksimum yang digunakan untuk produksi
2. Mikroskopi Elektron Transmisi Jika uji (1) dan/atau (2) memberikan hasil positif, lakukan uji infektivitas pada sel manusia yang sesuai dengan metode PERT assay pada beningan. Jika lini sel menghasilkan partikel retroviral (contoh: lini sel pengerat), uji retrovirus menggunakan:
   • Mikroskopi elektron transmisi.
   • Uji infektivitas pada sel manusia dan sel tambahan yang sesuai (contoh: sel Mus dunni atau sel SC-1 untuk sel substrat CHO) dengan metode PERT assay pada beningan, kecuali ketika sel amplifikasi positif terhadap reverse transcriptase, pembacaan dilakukan menggunakan metode plaque atau fluorescent focus.

Sensitivitas metode PERT sangat tinggi, sehingga interpretasi sinyal positif mungkin samar-samar dan keputusan keberterimaan sel substrat didasarkan pada data yang tersedia.

Uji pada mencit menyusu Uji dilakukan jika analisis risiko menunjukkan bahwa mitigasi risiko perlu dipertimbangkan terhadap semua pengujian pada sel substrat tertentu.

Suntikkan 107 sel hidup atau lisat sel yang setara, dalam beningan biakan pada kelompok mencit menyusu dari dua kelahiran yang berumur kurang dari 24 jam, tidak kurang dari 10 hewan. Suntikkan tidak kurang dari 0,1 mL secara intraperitonial dan 0,01 mL secara intraserebral.

Amati mencit menyusu selama tidak kurang dari 4 minggu. Investigasi mencit menyusu yang sakit atau memperlihatkan abnormalitas untuk menentukan penyebab penyakit. Sel substrat memenuhi syarat pengujian jika tidak ditemukan adanya agens asing. Pengujian invalid jika tidak kurang dari 80% mencit menyusu dari setiap kelompok tetap sehat dan bertahan hingga akhir masa pengamatan.

Uji pada telur (hanya untuk sel substrat unggas) Uji dilakukan jika analisis risiko menunjukkan bahwa mitigasi risiko perlu dipertimbangkan terhadap semua pengujian pada sel substrat tertentu. Suntikkan inokulum 106 sel hidup atau lisat sel yang setara, dalam beningan biakan ke dalam rongga alantoik 10 telur ayam berembrio bebas patogen spesifik berusia 9-11 hari dan ke dalam kantung kuning telur 10 telur ayam berembrio bebas patogen spesifik berusia 5-7 hari. Inkubasi selama tidak kurang dari 5 hari. Uji cairan alantoik menggunakan sel darah merah mamalia dan unggas untuk mengetahui terbentuknya haemaglutinin, lakukan pada suhu 5° ± 3° dan 20°- 25°, baca hasil setelah 30-60 menit. Sel substrat memenuhi syarat pengujian jika tidak ditemukan agens asing. Pengujian invalid jika tidak kurang dari 80% embrio tetap sehat dan bertahan hingga akhir masa pengamatan.

Uji untuk virus spesifik Daftar virus spesifik yang akan diuji ditentukan berdasarkan analisis risiko kontaminasi virus sesuai dengan prinsip-prinsip yang dirinci dalam Keamanan virus, dan memperhitungkan (tetapi tidak terbatas pada) asal sel dan sumber potensial kontaminasi virus (contoh: bahan yang berasal dari hewan atau tumbuhan). Uji Teknik Amplifikasi Asam Nukleat<1389> dilakukan dengan atau tanpa amplifikasi sebelumnya dalam sel. Untuk lini sel yang berasal dari hewan pengerat, Teknik Amplifikasi Asam Nukleat<1389> atau uji produksi antibodi dalam mencit, tikus, ataupun hamster digunakan untuk mendeteksi virus dengan spesies spesifik.

Uji virus menggunakan metode molekular lainnya Sesuai persetujuan dengan instansi yang berwenang, metode molekular lain (contoh: High Throughput Sequencing) dapat digunakan sebagai alternatif uji in vivo dan metode Teknik Amplifikasi Asam Nukleat spesifik, atau sebagai tambahan atau alternatif uji biakan sel in vitro berdasarkan analisis risiko.

Metode Teknik Amplifikasi Asam Nukleat dan metode molekular lainnya didasarkan pada analisis risiko dan tergantung pada langkah-langkah di mana kontaminan virus dapat ditetapkan. Dalam hal hasil positif dengan metode molekuler lain atau uji NAT, uji lebih lanjut harus dilakukan untuk menentukan apakah asam nukleat yang terdeteksi disebabkan oleh adanya agens asing yang menginfeksi dan/atau diketahui memiliki risiko terhadap kesehatan manusia.

Uji untuk tumorigenisitas in vivo Pengujian ini menetapkan perbandingan antara lini sel dan lini sel kontrol positif yang sesuai sebagai pembanding (contoh: sel HeLa atau sel Hep2). Hewan yang telah terbukti sesuai untuk pengujian ini meliputi:

1. Mencit atimik (genotipe Nu/Nu), 
2. Mencit, tikus, atau hamster baru lahir, yang diberi perlakuan dengan serum atau globulin antitimosit, 
3. Mencit yang telah dihilangkan kelenjar timus (timektomisasi) dan teriradiasi yang telah direkonstitusi (T-, B+) dengan sumsum tulang dari mencit yang sehat.

Pada hewan terpilih, lini sel dan sel kontrol positif disuntikkan ke dalam kelompok terpisah terdiri dari masing-masing 10 hewan. Dalam keduanya, inokulum untuk setiap hewan adalah 107 sel yang disuspensikan dengan volume 0,2 mL, dan penyuntikan dapat dilakukan melalui rute intramuskular atau subkutan. Hewan yang baru lahir diberi perlakuan dengan 0,1 mL serum atau globulin antitimosit pada hari ke-0, 2, 7, dan 14 setelah kelahiran. Serum atau globulin poten adalah yang dapat menekan mekanisme kekebalan (imun) hewan yang sedang berkembang hingga inokulum berikutnya dari 107 sel kontrol positif yang secara teratur menghasilkan tumor dan metastasis. Hewan yang terpengaruh sangat parah dan menunjukkan pertumbuhan tumor yang progresif, dapat dieutanasia sebelum uji berakhir, untuk menghindari penderitaan hewan yang tidak perlu. Pada akhir periode pengamatan, semua hewan termasuk kelompok kontrol positif dieutanasia dan diamati secara visual dan mikroskopis dari bukti proliferasi sel yang diinokulasi di tempat penyuntikan dan di organ lain (contoh: kelenjar getah bening, paru-paru, ginjal, dan hati). Semua hewan diamati dan dipalpasi secara berkala untuk mengetahui pembentukan nodul di lokasi penyuntikan. Setiap nodul yang terbentuk diukur dalam 2 arah tegak lurus, catat hasil pengukuran secara teratur untuk melihat pertumbuhan nodul yang progresif. Hewan yang menunjukkan nodul yang mulai mengalami regresi selama periode pengamatan dieutanasia sebelum nodul tidak lagi teraba, dan diproses untuk pemeriksaan histologis. 

Hewan dengan nodul yang semakin berkembang diamati selama 1-2 minggu. Di antara hewan yang tidak mengalami pembentukan nodul, setengahnya diamati selama 3 minggu dan setengah lainnya diamati selama 12 minggu sebelum dieutanasia dan dilakukan pemeriksaan histologis. Semua hewan dinekropsi dan dilakukan pemeriksaan terhadap pembentukan tumor di lokasi penyuntikan dan organ lain seperti kelenjar getah bening, paru-paru, otak, limpa, ginjal, dan hati. Semua lesi mirip tumor dan lokasi penyuntikan diperiksa secara histologis. Selain itu, karena beberapa lini sel dapat menimbulkan metastasis tanpa pertumbuhan tumor, setiap kelenjar getah bening regional yang terdeteksi dan paru-paru hewan diperiksa secara histologis.

Pengujian valid jika dari 10 hewan yang disuntik dengan sel kontrol positif baku, terdapat tidak kurang dari 9 hewan yang memperlihatkan pertumbuhan tumor secara progresif. Pada lini sel yang berpotensi menimbulkan tumor baru, didokumentasikan tingkat tumorigenisitas, dari berbagai dosis sel substrat (contoh: 105, 106, dan 107) disuntikkan dalam kelompok berbeda yang terdiri dari 10 hewan. Jumlah hewan yang menunjukkan pertumbahan nodul yang progresif dalam kelompok hewan dimonitor untuk dihitung TPD_50.