METODE IMUNOKIMIA <1385>

Metode imunokimia berdasarkan pengikatan non-kovalen antara antigen oleh antibodi yang bersifat, selektif dan reversibel. Metode ini digunakan untuk mendeteksi atau mengukur suatu antigen maupun antibodi. Pembentukan kompleks antigen-antibodi dapat dideteksi, dan jumlah kompleks yang terbentuk dapat diukur dengan berbagai cara. Hasil metode imunokimia tergantung pada kondisi uji, sifat, dan kualitas reagen yang digunakan. Penting untuk membakukan komponen immunoassay dan menggunakan baku pembanding internasional untuk immunoassay, jika tersedia.

Reagen yang diperlukan untuk banyak metode imunokimia tersedia dalam bentuk kit uji komersial, yaitu seperangkat reagen (terutama antigen atau antibodi) dan bahan-bahan yang dimaksudkan untuk estimasi in vitro bahan tertentu serta instruksi untuk penggunaan yang tepat. Penting untuk memastikan bahwa kit yang digunakan sesuai untuk analisis bahan yang akan diuji, dengan selektivitas dan sensitivitas tertentu.

METODE JIKA MENGGUNAKAN ANTIGEN ATAU ANTIBODI BERLABEL

Metode yang menggunakan bahan berlabel dapat menggunakan label yang sesuai seperti enzim, fluorofor, luminofor, dan radioisotop. Jika label yang digunakan adalah radioisotop, metode ini disebut sebagai "radio-immunoassay". Rekomendasi untuk pengukuran radioaktivitas yang tertera pada monografi yang berlaku untuk radio-immunoassay. Semua pekerjaan dengan bahan radioaktif harus dilakukan sesuai dengan peraturan nasional dan kode praktik yang diterima secara internasional untuk perlindungan terhadap bahaya radiasi.

METODE JIKA MENGGUNAKAN ANTIGEN ATAU ANTIBODI TIDAK BERLABEL

Metode Imunopresipitasi Metode imunopresipitasi mencakup reaksi flokulasi dan presipitasi. Ketika larutan antigen dicampur dengan antibodinya dalam kondisi yang sesuai, pereaksi akan membentuk endapan atau flokulasi agregat. Rasio campuran yang memberikan waktu flokulasi terpendek atau presipitasi paling tinggi disebut rasio optimal, dan biasanya dihasilkan dari antigen dan antibodi dalam jumlah setara. Imunopresipitasi dapat dinilai secara visual atau dengan teknik hamburan cahaya. Peningkatan sensitivitas diperoleh dengan menggunakan partikel dilapisi dengan antigen atau antibodi (misalnya lateks) sebagai pereaksi.

Dalam metode flokulasi, digunakan pengenceran bertahap dari salah satu pereaksi, sedangkan dalam metode imunodifusi, pengenceran diperoleh dengan difusi dalam media gel: gradien konsentrasi dari satu atau kedua pereaksi dicapai, sehingga menghasilkan zona dalam medium gel dimana perbandingan pereaksi sesuai endapan. Sedangkan metode flokulasi dilakukan dalam tabung, metode imunodifusi dapat menggunakan berbagai alat berbeda seperti tabung, lempeng kaca, atau bejana. Sistem imunopresipitasi sederhana terdiri dari satu antigen yang dicampur dengan antibodinya, sistem

imunopresipitasi kompleks melibatkan campuran yang terkait tetapi tidak identik secara serologis, dan sistem imunopresipitasi ganda menggunakan beberapa campuran yang tidak terkait secara serologis.

Dalam metode difusi sederhana, gradien konsentrasi ditetapkan hanya untuk satu pereaksi yang berdifusi dari sumber eksternal ke dalam media gel yang mengandung pereaksi sesuai pada konsentrasi relatif rendah.

Single radial immunodiffusion (SRID) adalah teknik imunodifusi kuantitatif yang sederhana. Ketika kesetimbangan antara pereaksi eksternal dan internal telah terbentuk, zona presipitasi sirkular, yang berasal dari lokasi pereaksi eksternal, berbanding lurus dengan jumlah antigen yang digunakan dan berbanding terbalik dengan konsentrasi antibodi dalam gel. Dalam metode difusi ganda, gradien konsentrasi ditetapkan untuk kedua pereaksi. Kedua antigen dan antibodi berdifusi dari sumur terpisah membentuk kompleks antigen antibodi yang dapat diamati secara visual.

Metode difusi ganda komparatif digunakan untuk membandingkan berbagai antigen secara kualitatif dengan antibodi yang sesuai atau sebaliknya. Perbandingan didasarkan pada ada tidaknya interaksi antara pola presipitasi. Reaksi identitas, non identitas atau parsial identitas dari antigen/antibodi dapat dibedakan. Metode imuno-elektroforesis Imunoelektroforesis adalah teknik kualitatif yang menggabungkan 2 metode: elektroforesis gel yang diikuti dengan imunodifusi.

Immunoelektroforesis silang digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Tahap pertama prosedur ini adalah elektroforesis gel biasa, setelah lempeng gel mengandung fraksi terpisah yang akan ditentukan, kemudian dipotong dan dipindahkan ke lempeng lain. Elektroforesis pada arah kedua dilakukan secara tegak lurus terhadap proses elektroforesis sebelumnya dalam gel yang mengandung antibodi yang sesuai dengan konsentrasi relatif rendah. Untuk konsentrasi antibodi tertentu dan ketebalan gel, hubungan antara luas puncak presipitasi masing-masing dan jumlah antigen yang sesuai harus linier.

Electroimmunoassay sering disebut sebagai rocket immunoelectrophoresis adalah metode kuantitatif cepat untuk menentukan antigen dengan muatan berbeda dari antibodi atau sebaliknya. Elektroforesis antigen yang akan ditentukan dilakukan dalam gel yang mengandung konsentrasi relatif lebih rendah dari antibodi yang sesuai. Bahan uji dan pengenceran antigen baku pembanding yang digunakan untuk kalibrasi dimasukkan ke dalam sumur berbeda dalam gel. Selama elektroforesis, terbentuk zona presipitasi berbentuk puncak yang bermigrasi dari sumur.

Bagian depan endapan tidak bergerak ketika tidak ada lagi antigen berlebih. Untuk konsentrasi antibodi tertentu, hubungan antara jarak yang ditempuh oleh endapan dan jumlah antigen yang digunakan harus linear.

Counter-immunoelectrophoresis adalah metode kuantitatif cepat dengan gradien konsentrasi antigen eksternal dan antibodi eksternal yang akan dibentuk dalam medan listrik tergantung pada muatan berbeda. Hasil pengenceran baku pembanding untuk kalibrasi dan pengenceran bahan uji dimasukkan ke dalam sumur pada gel dan sejumlah tetap pereaksi yang sesuai dimasukkan ke dalam sumur yang berseberangan. Titer bahan uji dapat ditentukan sebagai pengenceran tertinggi yang menunjukkan garis presipitasi.

Visualisasi dan karakterisasi garis imunopresipitasi

Metode ini dapat dilakukan dengan pewarnaan selektif atau non-selektif, fluoroesensi, pelabelan enzim, isotop atau teknik lain yang relevan. Metode pewarnaan selektif biasanya dilakukan untuk karakterisasi zat non-protein dalam endapan. Dalam gel tembus cahaya seperti agar atau agarosa, garis presipitasi menjadi jelas terlihat dalam gel, selama konsentrasi masing-masing pereaksi tepat.

VALIDASI METODE 

Kriteria validasi 

Metode imunokimia kuantitatif valid jika: 

1. Antibodi atau antigen tidak berbeda secara signifikan antara uji dan baku pembanding. Untuk pereaksi berlabel, pereaksi yang sesuai tidak berbeda secara signifikan antara senyawa berlabel dan tidak berlabel. 
2. Metode ini tidak terpengaruh oleh matriks pengujian, yaitu komponen lain dari bahan uji atau eksipiennya, yang dapat bervariasi antar bahan uji. Komponen lain dapat berupa protein lain, garam, pengawet, atau aktivitas proteolitik terkontaminasi dalam konsentrasi yang tinggi. 
3. Batas kuantitasi berada di bawah kriteria keberterimaan yang tertera pada masing-masing monografi. 
4. Presisi uji sesuai dengan variasi hasil yang memenuhi persyaratan seperti tertera pada masing-masing monografi. 
5. Pengujian dilakukan sedemikian sehingga tidak terjadi kesalahan sistematik.

Metode validasi Untuk memverifikasi kriteria tersebut di atas, desain validasi mencakup kriteria berikut: 

1. Pengujian dilakukan tidak kurang dari 3 (tiga) kali pengulangan (triplo). 
2. Pengujian mencakup tidak kurang dari 3 (tiga) pengenceran berbeda dari baku pembanding dan 3 (tiga) pengenceran bahan uji dari aktivitas yang diperkirakan sesuai dengan baku pembanding. 
3. Rancangan pengujian dilakukan secara acak. 
4. Jika bahan uji dalam bentuk serum atau diformulasikan dengan komponen lain, baku pembanding juga diperlakukan sama. 
5. Pengujian meliputi pengukuran ikatan non-spesifik pereaksi berlabel. 6) Untuk displacement immunoassay: 

• Tentukan ikatan maksimum (zero displacement) 
• Pengenceran mencakup rentang respon lengkap dari nilai yang dekat dengan ikatan non-spesifik hingga ikatan maksimum, sebaiknya untuk baku pembanding dan bahan uji.

PERHITUNGAN STATISTIK 

Untuk menganalisis hasil, kurva respons untuk pengujian dan standar dapat dianalisis dengan metode statistik yang sesuai. Jika grafik yang dihasilkan antibodi atau antigen antara bahan uji dan baku pembanding tidak paralel secara signifikan hasil dinyatakan tidak valid. Pada displacement immunoassay, nilai ikatan non-spesifik dan pemindahan maksimum pada konsentrasi bahan uji dan baku pembanding yang tinggi tidak boleh berbeda secara signifikan. Perbedaan dapat terjadi karena efek dari matriks, baik penghambatan ikatan, atau degradasi senyawa pelabel.