Uji mikoplasma untuk bank sel induk, bank sel kerja, lot benih virus atau sel kontrol, dapat dilakukan menggunakan metode kultur atau metode kultur sel indikator. Uji mikoplasma pada panenan virus, ruahan virus atau ruahan akhir (bets), dapat menggunakan metode kultur. Jika perlu metode kultur sel indikator juga dapat digunakan pada penapisan media. Teknik amplifikasi asam nukleat dapat digunakan sebagai pengganti satu atau kedua metode tersebut setelah divalidasi. Jika perlu lakukan modifikasi dan validasi dengan persetujuan instansi yang berwenang.
Metode Kultur
Pemilihan media kultur Uji dilakukan menggunakan sejumlah media, baik cair maupun padat untuk memastikan pertumbuhan pada kondisi inkubasi yang ditentukan dari sejumlah kecil mikoplasma yang mungkin terdapat di produk yang akan diuji. Media cair harus mengandung merah fenol. Media yang digunakan harus memenuhi faktor kecukupan nutrisi minimal untuk mikroorganisme yang dijelaskan di bawah ini. Faktor nutrisi dari tiap bets media baru diverifikasi terhadap daftar mikroorganisme yang sesuai. Ketika uji mikoplasma dilakukan, minimal satu jenis mikroorganisme berikut digunakan sebagai kontrol positif:
Acholeplasma laidlawii (vaksin manusia dan hewan jika antibiotik digunakan selama produksi). Mycoplasma gallisepticum (apabila menggunakan bahan dari avian selama produksi atau jika vaksin dibuat untuk penggunaan pada avian).
Mycoplasma hyorhinis (vaksin hewan non-avian) Mycoplasma orale (vaksin manusia dan hewan) Mycoplasma pneumoniae (vaksin manusia) atau menjadi spesies lain yang dapat memfermentasi glukosa, misalnya Mycoplasma fermentans. Mycoplasma synoviae (apabila menggunakan bahan dari avian selama produksi atau jika vaksin dibuat untuk penggunaan pada avian). Galur uji merupakan isolat yang telah mengalami pembatasan jumlah subkultur (tidak lebih dari 15), disimpan dalam kondisi beku atau beku-kering. Setelah perbanyakan, galur diidentifikasi dengan perbandingan jenis kultur, sebagai contoh:
Acholeplasma laidlawii BRP, Mycoplasma fermentans BRP, Mycoplasma hyorhinis BRP, Mycoplasma orale BRP, dan Mycoplasma synoviae BRP dapat digunakan sebagai galur baku dengan pasase rendah. Kondisi inkubasi Inkubasi media cair dalam wadah bersumbat pada suhu 35º - 38º. Inkubasi media padat pada kondisi mikroaerofilik (nitrogen dengan kandungan 5-10% karbon dioksida dan kelembaban yang cukup untuk menghindari pengeringan pada permukaan agar) pada suhu 35º-38º.
Sifat nutrisi
Lakukan pengujian sifat nutrisi pada tiap bets media baru. Inokulasi media yang dipilih menggunakan mikroorganisme uji yang sesuai; gunakan tidak lebih dari 100 CFU per 60 mm diameter cawan yang mengandung 9 mL media padat dan 100 mL wadah yang berisi media cair; gunakan cawan dan wadah terpisah untuk tiap jenis mikroorganisme. Inkubasikan media dan buat subkultur dari 0,2 mL media cair ke media padat dengan interval yang spesifik (lihat pada bagian uji mikoplasma pada produk yang diuji). Media padat memenuhi syarat apabila pertumbuhan koloni tiap mikroorganisme uji memadai (nilai pertumbuhan yang diperoleh dari hasil pengujian tidak boleh lebih besar dari lima faktor terhadap nilai perhitungan menggunakan inokulum yang sama). Media cair memenuhi syarat apabila pertumbuhan pada cawan subkultur dari broth ditemukan paling sedikit 1 subkulur untuk tiap mikroorganisme uji.
Senyawa inhibitor Uji senyawa inhibitor dilakukan satu kali untuk produk yang ditentukan dan diulang setiap kali ada perubahan dalam metode produksi yang dapat mempengaruhi deteksi mikoplasma. Untuk memastikan tidak adanya inhibitor, lakukan uji sifat nutrisi pada media dengan dan tanpa produk yang diuji. Jika pertumbuhan mikroorganisme uji terjadi pada 1 subkultur lebih awal tanpa produk uji dibandingkan dengan produk uji, atau jika plat yang diinokulasi dengan produk uji mempunyai jumlah koloni lebih rendah dari 1/5 jumlah uji dari yang diinokulasi tanpa produk uji artinya produk uji mengandung inhibitor dan inhibitor harus dinetralisasi atau efeknya dihilangkan. Contohnya, dengan pasase dalam media pertumbuhan yang tidak mengandung inhibitor atau pengenceran dengan volume medium lebih besar sebelum uji. Jika pengenceran dilakukan, volume media yang lebih besar dapat digunakan atau volume inokulum dibagi dalam beberapa labu 100 mL. Efektivitas netralisasi atau proses lain dapat diuji dengan mengulangi uji untuk zat penghambat setelah netralisasi.
Uji mikoplasma pada produk yang akan diuji Inokulasi 10 mL produk yang akan diuji dalam 100 mL tiap media cair. Apabila ditemukan adanya perubahan pH secara signifikan ketika penambahan produk yang akan diuji, kembalikan ke pH semula, dengan menambahkan larutan natrium hidroksida 20% atau asam hidroklorat. Inokulasi 0,2 mL produk yang akan diuji pada tiap cawan media padat. Inkubasi media cair selama 20-21 hari. Inkubasi media padat selama tidak kurang dari 14 hari, Kecuali subkultur 20-21 hari tersebut diinkubasi selama 7 hari pada media padat. Pada waktu yang sama, inkubasi 100 mL untuk tiap media cair dan cawan agar yang tidak diinokulasi sebagai kontrol negatif. Pada hari ke-2 sampai hari ke-4 setelah inokulasi, lakukan subkultur tiap media cair dengan menginokulasi 0,2 mL paling sedikit 1 cawan tiap media padat. Ulangi prosedur antara hari ke-6 dan ke-8, kemudian antara hari ke-13 dan ke-15, lalu antara hari ke-19 dan ke-21 setelah pengujian. Amati media cair setiap 2 sampai 3 hari dan jika terjadi perubahan warna, lakukan subkultur. Jika pada media cair terlihat kontaminasi bakteri atau jamur, maka pengujian tidak valid. Pengujian dikatakan valid apabila paling sedikit 1 cawan tiap media dan inokulasi tiap hari dapat diamati. Pada uji kontrol positif dilakukan dengan menginokulasi tidak lebih dari 100 CFU dari paling sedikit 1 mikroorganisme uji pada media agar atau media broth. Jika pengujian mikoplasma dilakukan secara rutin dan bila memungkinkan, disarankan untuk melakukan rotasi spesies mikoplasma yang digunakan sebagai kontrol positif. Uji mikroorganisme yang digunakan berdasarkan daftar media biakan.
Interpretasi hasil Pada akhir periode inkubasi yang ditentukan, amati seluruh media padat yang diinokulasi menggunakan mikroskop untuk melihat keberadaan koloni mikoplasma. Produk memenuhi syarat apabila tidak ada pertumbuhan jenis koloni mikoplasma. Produk dikatakan tidak memenuhi syarat jika ditemukan pertumbuhan koloni mikoplasma pada media padat. Pengujian dikatakan tidak valid apabila satu atau lebih kontrol positif tidak menunjukkan pertumbuhan mikoplasma setidaknya pada satu cawan subkultur. Pengujian dikatakan tidak valid apabila satu atau lebih kontrol negatif menunjukkan pertumbuhan mikoplasma. Jika terdapat koloni yang diduga mikoplasma, gunakan metode tervalidasi yang sesuai untuk menentukan apakah koloni tersebut merupakan koloni mikoplasma.
Rekomendasi Media Untuk Metode Kultur
Media di bawah ini direkomendasikan. Media lain dapat digunakan, jika media tersebut terbukti mampu mempertahankan pertumbuhan mikoplasma pada tiap bets dengan ada dan tidak adanya produk yang diuji.
Hayflick Media (Rekomendasi untuk pendeteksian umum mikoplasma)
Media cair
| Beef heart infusion broth (1) | 90,0 mL |
| Serum kuda (tidak dipanaskan) | 20,0 mL |
| Ekstrak Ragi (250 g/L) | 10,0 mL |
| Merah fenol (larutan 0,6 g/L) | 5,0 mL |
| Penisilin (20 000 IU/mL) | 0,25 mL |
| Asam Deoksiribonukleat | 1,2 mL |
| Atur hingga pH 7,8 |
Media padat
Siapkan bahan seperti media cair dengan mengganti beef heart infusion broth dengan beef heart infusion agar yang mengandung agar 15 g per L
Frey Media (Rekomendasi untuk deteksi M. synoviae)
Media cair
| Beef heart infusion broth (1) | 90,0 mL |
| Vitamin esensial (2) | 0,025 mL |
| Glukosa monohidrat (larutan 500 g per L) | 2,0 mL |
| Serum babi (inaktifasi pada suhu 56º selama 30 menit) | 12,0 mL |
| β-Nikotinamida adenin dinukleotida (larutan 10 g per L) | 1,0 mL |
| Sistein hidroklorida (larutan 10 g per L) | 1,0 mL |
| Merah fenol (larutan 0,6 g per L) | 5,0 mL |
| Penisilin (20.000 IU per mL) | 0,25 mL |
Campur larutan β-Nikotinamida adenin dinukleotida dan sistein hidroklorida kemudian tambahkan bahan lain setelah 10 menit. Atur hingga pH 7,8.
Media padat
| Beef heart infusion broth (1) | 90,0 mL |
| Agar, dimurnikan (3) 1,4 g Atur hingga pH 7,8, sterilisasi dengan autoklaf kemudian tambah: | 1,4 g |
| Vitamin esensial (2) | 0,025 mL |
| Glukosa monohidrat (larutan 500 g per L) | 2,0 mL |
| Serum babi (tidak dipanaskan) | 12,0 mL |
| β-Nikotinamida adenin dinukleotida (larutan 10 g per L) | 1,0 mL |
| Sistein hidroklorida (larutan 10 g per L) | 1,0 mL |
| Merah fenol (larutan 0,6 g per L) | 5,0 mL |
| Penisilin (20 000 IU per mL) | 0,25 mL |
Media Friis (Direkomendasikan untuk deteksi non avian mikoplasma
Hanks’ balanced salt solution (modifikasi) | 800 mL |
| Air | 67mL |
| Brain heart infusion (5) | 135 mL |
| PPLO Broth (6) | 248 mL |
| Ekstrak ragi (170 g per L) | 60 mL |
| Basitrasin | 250 mg |
| Metisilin | 250 mg |
| Merah fenol (5 g per L) | 4,5 mL |
| Serum kuda (larutan 10 g per L) | 165 mL |
| Serum babi | 165 mL |
| Atur hingga pH 7,40 – 7,45 |
Media padat
Hanks’ balanced salt solution (modifikasi) (4) | 200 mL |
| DEAE-dekstran | 200 mg |
| Agar, dimurnikan (3) | 15,65 g |
Campur dan sterilisasi dengan autoklaf. Dinginkan hingga suhu 100º. Tambahkan ke dalam 1740 ml media cair diatas. | |
1) Beef heart infusion broth | |
| Beef heart (untuk penyiapan infus) | 500 g |
| Pepton | 10 g |
| Natrium klorida | 5 g |
| Air hingga | 1000 mL |
| Sterilisasi dengan autoklaf | |
2) Vitamin esensial | |
| Biotin | 100 mg |
| Kalsium pantotenat | 100 mg |
| Kholin klorida | 100 mg |
| Asam folat | 100 mg |
| i-Inosito | 200 mg |
| Nikotinamida | 100 mg |
| Piridoksal hidroklorida | 100 mg |
| Riboflavin | 10 mg |
| Tiamin hidroklorida | 100 mg |
| Air hingga | 1000 mL |
3) Agar, dimurnikan | |
Agar untuk penggunaan mikrobiologi dan imunologi, disiapkan dengan prosedur penukar ion yang menghasilkan produk dengan kemurnian tinggi, kejernihan dan kepadatan gel. Agar mengandung: | |
| Air | 12,2 % |
| Abu | 1,5 % |
| Abu tidak larut asam | 0,2 % |
| Klorin | 0 |
| Fosfat (dihitung sebagai P2O5) | 0,3 % |
| Total nitrogen | 0,3 % |
| Tembaga | 8 ppm |
| Besi | 170 ppm |
| Kalsium | 0,28 % |
| Magnesium | 0,32 % |
4) Hanks’ balanced salt solution (modifikasi) | |
| Natrium klorida | 6,4 g |
| Kalium klorida | 0,32 g |
| Magnesium sulfat heptahidrat | 0,08 g |
| Magnesium klorida heksahidrat | 0,08 g |
| Kalsium klorida anhidrat | 0,112 g |
| Disodium hidrogen fosfat dihidrat | 0,0596 g |
| Kalium dihidrogen fosfat anhidrat | 0,048 g |
| Air hingga | 800 mL |
5) Brain heart infusion | |
| Calf brain infusion | 200 g |
| Beef heart infusion | 250 g |
| Proteose peptone | 10 g |
| Glukosa monohidrat | 2 g |
| Natrium klorida | 5 g |
| Dinatrium hidrogen fosfat, anhidrat | 2,5 g |
| Air hingga | 1000 mL |
6) PPPLO Broth | |
| Beef heart infusion | 50 g |
| Pepton | 10 g |
| Natrium klorida | 5 g |
| Air hingga | 1000 mL |
Metode Kultur Sel Indikator
Kultur sel diwarnai dengan pewarna fluorosens yang berikatan dengan DNA. Mikoplasma dideteksi dari karakteristik partikulatnya atau pola berserabut fluorosens pada permukaan sel dan jika terjadi kontaminasi tingkat tinggi, terlihat di sekeliling area. Mitokondria dalam sitoplasma dapat terwarnai tetapi mudah dibedakan dari mikoplasma.
Jika untuk suspensi virus, interpretasi hasil dipengaruhi oleh efek sitopatik, virus dapat dinetralkan menggunakan antiserum yang tidak memiliki efek penghambat pada mikoplasma atau substrat sel kultur yang tidak menyebabkan pertumbuhan virus. Untuk membuktikan tidak ada efek penghambat serum, lakukan uji kontrol positif dengan menggunakan dan tidak menggunakan antiserum.
Verifikasi Substrat
Gunakan sel vero atau kultur sel lain (contoh lini sel produksi) yang setara keefektivitasannya dalam mendeteksi mikoplasma. Uji efektifitas sel digunakan dengan menerapkan prosedur di bawah ini dan inokulasi tidak lebih dari 100 CFU atau CFU-Like microorganism galur baku M. hyorhinis dan M. orale dari:
M. hyorhinis | ATCC 29052 | ||
M. orale | NCTC 10112 | CIP104969 | ATCC 23714 |
Sel dapat digunakan jika kedua galur baku tersebut terdeteksi. Sel indikator harus disubkultur tanpa antibiotik sebelum digunakan pada uji.
Metode Uji
Interpretasi Hasil
Produk yang diuji memenuhi syarat jika tidak terdapat fluorosensi spesifik mikoplasma. Uji tidak memenuhi syarat jika kontrol positif tidak menunjukkan fluorosensi spesifik mikoplasma dan jika kontrol negatif menunjukkan fluorosensi spesifik mikoplasma.
Teknik Amplifikasi Asam Nukleat
Teknik amplifikasi asam nukleat dapat digunakan untuk deteksi mikoplasma dengan amplifikasi asam nukleat yang diekstraksi dari sampel uji dengan primer spesifik terhadap asam nukleat target. Teknik amplifikasi asam nukleat menunjukkan urutan asam nukleat tertentu dan tidak memerlukan mikoplasma hidup. Terdapat sejumlah teknik yang berbeda. Prosedur lain dapat digunakan, namun harus divalidasi seperti tertera pada pedoman yang tercantum pada akhir bagian ini. Jika kit komersial digunakan, terdapat parameter tertentu yang harus divalidasi oleh produsen dan diinformasikan kepada pengguna.
Teknik amplifikasi asam nukleat diterapkan jika ditetapkan pada monografi. Teknik amplifikasi asam nukleat juga dapat digunakan sebagai pengganti metode kultur dan metode kultur sel indikator setelah dilakukan validasi yang sesuai.
Teknik amplifikasi asam nukleat langsung Dapat diterapkan jika terdapat bahan sitotoksik dan jika metode cepat diperlukan.
Pengkayaan kultur sel diikuti oleh Teknik amplifikasi asam nukleat Uji sampel dan substrat sel yang sesuai (seperti yang dijelaskan di bawah metode kultur sel indikator) dikultur bersama selama periode tertentu, asam nukleat kemudian diekstraksi dari sel dan beningan serta digunakan untuk deteksi dengan teknik amplifikasi asam nukleat.
Validasi
Baku pembanding diperlukan pada berbagai tahap selama validasi dan untuk penggunaan sebagai kontrol selama pengujian rutin. Baku pembanding berupa mikoplasma atau asam nukleat. Untuk validasi batas deteksi, spesies berikut ini merupakan pilihan optimal jika dilihat dari frekuensi kejadian kontaminasi dan hubungan filogenetik antar spesies mikoplasma:
Validasi spesifisitas memerlukan penggunaan spesies bakteri yang sesuai selain mikoplasma. Genus bakteri dengan filogenetik yang memiliki kekerabatan dekat dengan mikoplasma lebih sesuai untuk validasi ini meliputi Clostridium, Lactobacillus dan Streptococcus.
Studi perbandingan untuk penggunaan Teknik amplifikasi asam nukleat sebagai metode alternatif Untuk tiap spesies uji mikoplasma:
Atau batas deteksi yang setara dengan jumlah salinan asam nukleat mikoplasma dalam sampel uji (menggunakan baku pembanding asam nukleat mikoplasma yang sesuai).
Kontrol Internal Kontrol internal dibutuhkan untuk verifikasi rutin adanya penghambat. Kontrol internal dapat mengandung urutan yang dikenali primer atau beberapa urutan lain yang sesuai. Kontrol internal hendaknya ditambahkan ke bahan uji sebelum isolasi asam nukleat sehingga dapat berlaku sebagai kontrol keseluruhan (ekstraksi, transkripsi balik, amplifikasi, deteksi).
Kontrol eksternal Kontrol positif eksternal mengandung sejumlah salinan urutan target atau CFU dari 1 atau lebih spesies mikoplasma yang sesuai yang dipilih selama validasi uji. Satu dari kontrol positif diatur dekat dengan titik cut-off positif untuk menunjukkan sensitifitas yang diharapkan tercapai. Kontrol negatif eksternal tidak mengandung urutan target tapi tidak mewakili matriks yang sama sebagai bahan uji.
Interpretasi Hasil Primer yang digunakan juga dapat mengamplifikasi asam nukleat bakteri non mikoplasma, yang mengarah ke hasil positif palsu. Jika diperlukan, prosedur ditetapkan pada waktu validasi untuk menangani konfirmasi hasil positif.
Pedoman Validasi Amplifikasi Asam Nukleat Untuk Deteksi Mikoplasam
Ruang Lingkup
Teknik Amplifikasi asam nukleat adalah uji kualitatif atau kuantitatif adanya asam nukleat. Untuk deteksi kontaminasi mikoplasma dari variasi sampel seperti vaksin dan substrat sel, uji kualitatif cukup dan dapat dipertimbangkan sebagai uji batas. Pedoman ini menjelaskan metode untuk validasi prosedur analitik amplifikasi asam nukleat kualitatif untuk mendeteksi kontaminasi mikoplasma. Metode tersebut berlaku untuk teknik amplifikasi asam nukleat real time yang digunakan untuk kontrol kontaminasi sebagai uji batas.
Dua karakteristik yang dianggap paling penting untuk validasi prosedur analitik adalah spesifisitas dan batas deteksi. Ketegaran prosedur analitik harus dievaluasi. Untuk tujuan dokumen ini, prosedur analitik didefiniskan sebagai prosedur lengkap dari ekstraksi asam nukleat untuk deteksi produk yang diamplifikasi. Jika kit komersial digunakan untuk sebagian atau semua prosedur analitik, validasi terdokumentasi sudah dilakukan oleh produsen kit yang dapat menggantikan validasi oleh pengguna. Meskipun demikian, kinerja kit sehubungan dengan tujuan penggunaanya harus dibuktikan oleh pengguna (misal batas deteksi, ketegaran, deteksi silang bakteri klas lain).
Teknik amplifikasi asam nukleat dapat digunakan sebagai:
Pedoman ini memiliki 2 tujuan yaitu untuk validasi amplifikasi asam nukleat dan untuk studi pembanding antara amplifikasi asam nukleat dan metode kompendial.
Pedoman Untuk Validasi Mikoplasma Teknik Amplifikasi Asam Nukleat
Tiga parameter yang harus dievaluasi: spesifisitas, batas deteksi dan ketegaran.
1. Spesifisitas
Spesifisitas adalah kemampuan untuk menilai dengan jelas asam nukleat target yang terdapat pada sampel. Spesifisitas teknik amplifikasi asam nukleat tergantung pada pemilihan primer, pelacak (untuk analisis produk jadi) dan keketatan kondisi uji (untuk tahap amplifikasi dan deteksi).
Kemampuan teknik amplifikasi asam nukleat untuk mendeteksi beragam spesies mikoplasma akan bergantung pada pemilihan primer, probe dan parameter metode. Kemampuan ini harus dibuktikan menggunakan baku. Oleh karena teknik amplifikasi sistem asam nukleat berdasarkan campuran primer, perbandingan database analisis primer dan pelacak tidak direkomendasikan. Hal ini karena interpretasi hasil rumit dan tidak menggambarkan hasil uji. Selain itu primer akan mendeteksi spesies bakteri lain, potensi deteksi silang harus didokumentasikan dalam studi validasi. Genus bakteri dengan filogenetik yang memiliki kekerabatan dekat dengan mikoplasma lebih sesuai untuk validasi ini meliputi Clostridium, Lactobacillus dan Streptococcus. Namun tidak hanya genus bakteri tersebut dan spesies yang diuji akan bergantung pada kemampuan teoritis (berdasarkan pada urutan primer/probe) sistem Teknik amplifikasi asam nukleat untuk mendeteksi spesies lain.
Berdasarkan pada hasil validasi spesifisitas, jika terdapat perbedaan dalam spesifisitas metode (seperti deteksi asam nukleat bakteri non mikoplasma), strategi yang sesuai harus dilakukan dalam studi validasi untuk menghasilkan interpretasi hasil positif pada pengujian rutin. Misal uji kedua dapat dilakukan menggunakan metode alternatif tanpa perbedaan spesifisitas atau menggunakan metode kompendial.
2. Batas Deteksi
Batas deteksi prosedur analitik adalah jumlah terendah asam nukleat target dalam sampel yang dapat dideteksi tapi tidak dikuantifikasi sebagai nilai yang tepat. Untuk penetapan batas deteksi, titik cut off positif harus ditentukan untuk prosedur analitik amplifikasi asam nukleat. Titik cut off positif adalah jumlah minimum salinan urutan target per volume uji yang dapat dideteksi pada 95% ulangan pengujian. Titik cut off positif dipengaruhi oleh distribusi genom mikoplasma dalam sampel individu yang diuji dan faktor seperti efisiensi enzim dan dapat menghasilkan perbedaan 95% nilai cut off untuk setiap uji.
Untuk menentukan titik cut off positif, seri pengenceran dikarakterisasi dan dikalibrasi (dalam CFU atau salinan asam nukleat) dalam galur baku kerja atau standar kompendial harus diuji pada hari berbeda untuk menentukan variasi antar uji.
Untuk validasi batas deteksi, spesies berikut ini mewakili seleksi optimal sebagai kontaminan dan hubungan filogenetik:
Untuk setiap galur, minimal 3 seri independen pengenceran kelipatan 10 harus diuji, dengan sejumlah replikasi pada setiap pengenceran dengan jumlah total 24 hasil uji, untuk mendapatkan hasil analisis statistik. Misalnya dilakukan 3 seri pengenceran pada hari berbeda dengan 8 replikasi untuk tiap pengenceran, 4 seri pengenceran pada hari berbeda dengan 6 replikasi untuk tiap pengenceran, atau 6 seri pengenceran pada hari berbeda dengan 4 replikasi untuk tiap pengenceran. Untuk menetapkan jumlah pengenceran pada tahap yang dapat dikendalikan, uji pendahuluan harus dilakukan untuk mendapatkan nilai awal titik cut off positif (misalnya pengenceran tertinggi memberikan respon positif). Rentang pengenceran dapat dipilih sekitar titik cut off awal yang telah ditentukan. Konsentrasi mikoplasma (CFU atau salinan) dapat dideteksi pada 95% uji yang dapat dihitung menggunakan metode statistik yang sesuai. Hasil tersebut dapat digunakan untuk menilai variabilitas prosedur analitik.
3. Ketegaran
Ketegaran adalah ukuran kemampuan prosedur untuk tetap bertahan dan tidak terpengaruh oleh parameter metode dengan variasi kecil yang disengaja pada parameter dan menyediakan indikasi keandalan metode selama penggunaan normal. Evaluasi ketegaran harus dipertimbangkan pada tahap pengembangan metode. Evaluasi seharusnya menunjukkan keandalan prosedur analitik yang parameter metodenya divariasi dengan disengaja. Untuk amplifikasi asam nukleat, variasi kecil dalam parameter metode bersifat kritis. Namun, ketegaran metode dapat dilakukan selama pengembangan ketika variasi kecil dalam konsentrasi reagen dilakukan (misal MgCl2, primer atau deoksiribonukleotida). Evaluasi harus dilakukan apabila terdapat modifikasi kit ekstraksi atau prosedur ekstraksi serta jenis alat PCR. Ketegaran suatu metode dapat dievaluasi melalui studi kolaborasi.
Pedoman Studi Komparibilitas
Teknik amplifikasi asam nukleat dapat digunakan sebagai pengganti metode kompendial (metode kultur sel indikator atau metode kultur). Dalam kasus ini, studi komparibilitas harus dilakukan. Studi komparibilitas ini harus meliputi perbandingan batas deteksi respektif (masing-masing) metode alternatif dan metode kompendial. Tetapi spesifisitas (mikoplasma terdeteksi, hasil positif palsu yang diprediksi) harus dipertimbangkan. Untuk batas deteksi, kriteria penerimaan didefinisikan sebagai berikut:
Untuk kedua kasus, standar terkalibrasi yang sesuai untuk sejumlah salinan asam nukleat dan sejumlah CFU dapat digunakan untuk memenuhi penetapan kriteria keberterimaan. Hubungan antara CFU dan salinan asam nukleat untuk sediaan baku harus ditetapkan sebelumnya untuk membandingkan kinerja metode Teknik amplifikasi asam nukleat dengan kinerja metode kompendial.
Satu dari dua strategi di bawah ini dapat digunakan untuk menunjukkan studi komparibilitas:
Laporan studi komparabilitas seharusnya menjelaskan semua elemen validasi (spesifisitas, batas deteksi dan variabilitas dan ketegaran) untuk menilai semua kelebihan dan kekurangan metode amplifikasi asam nukleat alternatif dibandingkan dengan metode kompendial.