AGENS ASING DALAM VAKSIN VIRUS <72>

Metode untuk menguji agens asing dalam vaksin virus harus dikembangkan berdasarkan analisis risiko mengikuti prinsip risiko kontaminasi virus sesuai Keamanan virus.
Metode ini mencakup pengujian yang sesuai untuk mendeteksi berbagai kelompok agens asing yang dapat menginfeksi sumber galur virus termasuk substrat sel dan bahan baku yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Hal ini juga mempertimbangkan kapasitas proses pembuatan untuk menghilangkan atau menginaktivasi virus. Daftar uji yang terdapat dalam Tabel 1 harus disesuaikan tergantung pada agens asing yang berpotensi mengkontaminasi produk; untuk uji in vitro, analisis risiko dapat dilakukan dengan persetujuan instansi berwenang, penggunaan lini sel lain atau metode biologi molekuler tergantung pada proses pembuatan dan suhu inkubasi untuk pertumbuhan virus tertentu. Jika uji in vivo lebih relevan daripada uji in vitro untuk mendeteksi beberapa virus adventitious (misalnya mencit menyusu untuk virus stomatitis vesikular dan telur fertil bebas patogen spesifik/Specific Pathogen Free (SPF) untuk virus influenza), pemilihan uji in vivo harus ditetapkan berdasarkan analisis risiko. 

Metode molekular baru yang sensitif dengan kemampuan deteksi luas dilakukan menggunakan High-Throughput Sequencing (HTS) methods, Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT) (e.g. Polymerase Chain Reaction (PCR), Reverse Trancriptase PCR (RT-PCR), Product-Enhanced Reverse Transcriptase (PERT) assays) untuk keseluruhan kelompok virus atau metode random-priming (dengan atau tanpa sekuensing), hibridisasi pada susunan oligonukleotida, dan spektrofotometri massa dengan PCR spektrum luas. Metode ini dapat digunakan sebagai alternatif untuk uji in vivo dan Teknik Amplifikasi Asam Nukleat spesifik atau sebagai alternatif untuk uji kultur in vitro berdasarkan analisis risiko dengan persetujuan instansi berwenang. Dalam uji yang memerlukan netralisasi virus sebelumnya, gunakan antibodi spesifik yang bukan berasal dari manusia atau simian, jika virus dikembangbiakkan dalam jaringan avian, antibodi juga harus bukan berasal dari avian. Untuk membuat antiserum, gunakan antigen yang diproduksi dalam biakan sel dari spesies berbeda dari yang digunakan untuk membuat vaksin dan bebas dari agens asing. Jika digunakan telur SPF, telur diperoleh dari sekelompok SPF <1411>.

METODE UJI 

Pengujian untuk agens asing yang dilakukan pada berbagai tahap produksi ditunjukkan pada Tabel 1. menggunakan metode yang dijelaskan di bawah ini, berdasarkan analisis risiko. Ambil sampel pada saat panen, dan jika tidak segera diuji, simpan pada suhu di bawah -40o.

Tabel 1. Uji yang relevan untuk agens asing pada berbagai tahap produksi

1. Jika menggunakan serangga atau bahan baku yang berasal dari tanaman. 
2. Jika analisis risiko menunjukkan bahwa mitigasi risiko perlu dipertimbangkan terhadap semua pengujian pada sel substrat tertentu. 
3. Jika virus dikembangbiakkan dalam avian atau jaringan primer avian. Jika analisis risiko menunjukkan bahwa mitigasi risiko perlu dipertimbangkan terhadap semua pengujian pada sel substrat tertentu. 
4. Uji dilakukan dalam biakan sel yang sesuai. Berdasarkan analisis risiko 
5. Jika virus dikembangbiakkan dalam sel serangga. 
6. Jika virus dikembangbiakkan dalam jaringan primer avian atau telur. 
7. Berdasarkan analisis risiko. 
8. Metode ini dapat digunakan sebagai alternatif untuk uji in vivo dan Teknik Amplifikasi Asam Nukleat spesifik atau sebagai alternatif untuk uji kultur in vitro berdasarkan analisis risiko dengan persetujuan instansi berwenang.

Kontaminasi bakteri dan jamur Setiap lot benih virus dan panenan virus memenuhi uji sterilitas <71>

Mikoplasma<74> Setiap lot benih virus dan panenan virus memenuhi uji mikoplasma.

Spiroplasma Spiroplasma dapat masuk ke dalam lot benih virus melalui kontaminasi bahan baku yang berasal dari tanaman atau ketika lini sel serangga digunakan untuk perkembangbiakkan virus. Jika perlu, lot benih virus dibuktikan bebas dari spirosplasma menggunakan metode tervalidasi dan disetujui oleh instansi berwenang. Metode Teknik Amplifikasi Asam Nukleat <1389> untuk deteksi Uji Keberadaan mikoplasma<74> dapat digunakan untuk mendeteksi spiroplasma setelah validasi dan disetujui oleh instansi berwenang.

Mikobakteria <73> Sejumlah 2,7 mL sampel dari setiap lot benih virus dan setiap panenan virus diuji untuk memeriksa keberadaan Mycobacterium spp. dengan metode kultur yang sensitif untuk mendeteksi organisme ini. Teknik Amplifikasi Asam Nukleat <1389> dapat digunakan sebagai alternatif, jika pengujian tersebut divalidasi dan terbukti sebanding dengan metode kultur.

Mencit menyusui Setiap lot benih virus diuji pada mencit menyusu Jika analisis risiko menunjukkan bahwa mitigasi risiko perlu dipertimbangkan terhadap semua pengujian pada sel substrat tertentu. Inokulasi tidak kurang dari 20 hewan uji, masing-masing berumur kurang dari 24 jam, suntikkan 0,01 mL lot benih virus secara intraserebral dan tidak kurang dari 0,1 ml secara intraperitoneal. Amati hewan uji setiap hari selama tidak kurang dari 4 minggu. Lakukan autopsi terhadap semua hewan uji yang mati setelah 24 jam pertama uji atau yang menunjukkan gejala penyakit, dan periksa bukti infeksi virus yang disebabkan oleh lot benih. Uji ini valid apabila tidak kurang dari 80% hewan uji hidup selama pengamatan.

Virus Avian Setiap lot benih virus yang dikembangbiakkan dalam jaringan avian dan setiap panenan virus yang dikembangbiakkan dalam jaringan primer avian diuji untuk virus avian. Jika analisis risiko menunjukkan bahwa mitigasi risiko perlu dipertimbangkan terhadap semua pengujian pada sel substrat tertentu. Netralkan sampel setara dengan vaksin 100 dosis manusia atau 10 mL, atau jumlah lebih besar. Menggunakan 0,5 mL per telur, inokulasikan satu kelompok telur fertil SPF, berumur 9-11 hari, melalui rute alantoik dan kelompok kedua, 5-7 hari, ke dalam kantung kuning telur. Inkubasi selama 7 hari. Lot benih virus atau panenan memenuhi uji jika cairan alantoik dan kantung kuning telur tidak menunjukkan tanda keberadaan senyawa yang mengaglutinasi dan jika semua embrio dan membran korion-alantoik yang diuji untuk patologi makroskopis, adalah normal. Uji ini tidak valid kecuali setidaknya 80% dari telur yang diinokulasi bertahan selama 7 hari.

Uji agens asing dalam kultur sel Untuk setiap lot benih virus, setiap panenan virus dan setiap produksi kultur sel (sel kontrol atau telur kontrol), uji untuk agens asing lainnya harus dilakukan berdasarkan analisis risiko. Sumber substrat sel dan galur virus, serta potensi agens asing yang dapat secara tidak sengaja terdeteksi selama proses produksi atau melalui penggunaan bahan baku dari hewan atau tumbuhan, harus diperhitungkan ketika memilih sel yang sesuai. Untuk setiap lot benih virus dan panenan virus, sampel yang dinetralisasi, kecuali ditentukan lain, setara dengan 500 dosis vaksin manusia atau 50 mL, jika lebih besar, diuji untuk keberadaan agens asing dengan menginokulasi ke dalam kultur sel manusia dan simian yang berkesinambungan. Jika virus dikembangbiakkan dalam sel simian atau sel manusia, panenan virus yang dinetralisasi diuji dalam kultur terpisah dari sel tersebut. Jika virus dikembangkan dalam sistem sel mamalia selain simian atau manusia, atau dalam sel avian, sel dari spesies tersebut, namun berasal dari bets yang terpisah, juga diinokulasi. Sel diinkubasi pada suhu 36±1º dan amati selama 14 hari. Jika produksi kultur sel dipertahanakan pada suhu selain 36±1º, uji tambahan untuk agens asing dilakukan pada suhu produksi menggunakan jenis sel sama yang digunakan untuk pertumbuhan virus. Subkultur berumur 14 hari diuji diikuti oleh uji haemadsorbsi. Lot benih atau panenan virus memenuhi syarat uji jika tidak ada kultur sel yang menunjukkan keberadaan agens asing setelah 14 dan 28 hari inkubasi, dan tidak ada bukti adanya virus haemadsorbsi setelah 28 hari. Uji dinyatakan valid jika tidak kurang dari 80% dari kultur sel tetap hidup.

Virus serangga Setiap lot benih virus dan panenan virus yang dikembangbiakkan dalam sel serangga diuji untuk virus serangga. Sampel yang dinetralisasi, kecuali ditentukan lain, setara dengan 500 dosis vaksin manusia atau 50 mL, atau jumlah yang lebih besar, diuji keberadaan agens asing dengan menginokulasi ke dalam minimal 1 kultur sel yang berbeda dari yang digunakan dalam produksi dan diperbolehkan untuk virus serangga dan juga memungkinkan untuk deteksi arbovirus manusia (misalnya BHK-21). Pilihan sel disetujui oleh instansi berwenang dan mempertimbangkan sumber produksi sel dan kontaminan sejenis yang dapat dideteksi oleh sel yang dipilih. Sel diinkubasi pada suhu yang sesuai dan diamati selama 14 hari. Lakukan subkultur berumur 14 hari dan dilanjutkan dengan uji haemadsorbsi. Lot benih atau panenan virus lulus uji jika tidak ada kultur sel yang menunjukkan keberadaan agens asing setelah 14 dan 28 hari inkubasi, dan tidak ada bukti keberadaan virus haemadsorbsi setelah 28 hari. Uji dinyatakan valid jika tidak kurang dari 80% dari kultur sel tetap hidup.

Uji pada sel kontrol Jika kultur sel digunakan dalam pembuatan virus, periksa sel kontrol secara mikroskopis untuk memastikan tidak adanya virus yang menyebabkan efek sitopatik selama waktu inkubasi kultur sel yang telah diinokulasi atau tidak kurang dari 14 hari setelah inokulasi wadah produksi, atau yang lebih lama. Uji dinyatakan valid jika tidak kurang dari 80% dari kultur sel kontrol tetap hidup sampai akhir periode pengamatan. Pada hari ke 14 atau pada saat panenan virus terakhir, kumpulkan beningan sel kontrol dan periksa keberadaan agens asing selama periode 14 hari seperti yang dijelaskan di atas untuk lot benih virus dan panenan virus dengan inokulasi kultur sel yang relevan tergantung pada jenis sel yang digunakan untuk pertumbuhan virus.

Virus Haemadsorbsi Jika kultur sel digunakan untuk produksi virus, pemeriksaan mikroskopis sel kontrol dilakukan seperti yang dijelaskan di atas untuk pengujian agens asing dalam kultur sel. Pada hari ke 14 atau pada saat panenan virus terakhir, periksa tidak kurang dari 25% kultur kontrol untuk keberadaan virus haemadsorbsi dengan penambahan sel darah merah marmot. Jika tidak memungkinkan dilakukan uji virus haemadsorbsi, lakukan uji virus haemaglutinasi. Sel darah merah marmot dapat disimpan pada suhu 5±3º selama tidak lebih dari 7 hari. Periksa setengah dari biakan setelah inkubasi pada suhu 5±3º selama 30 menit dan separuh lainnya setelah inkubasi pada suhu 20-25º selama 30 menit: tidak ditemukan adanya agen haemadsorbsi.

Uji pada telur kontrol Jika telur digunakan untuk produksi virus, uji 0,25 mL cairan alantoik dari setiap telur kontrol untuk agen hemaglutinasi dengan mencampur langsung sel darah merah ayam dan setelah pasase pada telur SPF lakukan sebagai berikut: inokulasi 5 mL sampel cairan amnion yang dikumpulkan dari telur kontrol masing-masing 0,5 mL ke dalam rongga alantoik dan rongga amnion telur SPF. Telur kontrol memenuhi syarat uji jika tidak ditemukan keberadaan agen hemaglutinasi. Selain itu, inokulasi 5 mL sampel yang dikumpulkan dari cairan amnion dari telur kontrol ke dalam sel yang sesuai termasuk sel manusia, simian, dan avian. Amati kultur sel selama 14 hari pada suhu inkubasi yang sesuai. Telur kontrol memenuhi syarat uji jika tidak ditemukan agens asing. Uji dinyatakan valid jika tidak kurang dari 80% kultur yang diinokulasi bertahan sampai akhir periode pengamatan.

Virus leukosis avian Untuk setiap virus yang dikembangbiakkan dalam jaringan sel avian primer atau dalam telur, kultur sel produksi (sel kontrol atau telur kontrol) diuji untuk virus leukosis avian. Jika kultur sel digunakan untuk produksi virus, pemeriksaan mikroskopis sel-sel kontrol dilakukan seperti yang dijelaskan di atas untuk uji agens asing sebelum dilakukan uji untuk virus leukosis avian. Pada hari ke 14 atau pada saat panenan virus terakhir, lakukan uji virus leukosis avian pada sel DF1 atau kultur sel embrio ayam bebas leukosis dengan amplifikasi melalui 5 pasase menggunakan tidak kurang dari 5 mL bening dari sel kontrol atau tidak kurang dari 10 mL sampel cairan amnion yang dikumpulkan dari telur kontrol. Uji titik akhir PERT dapat digunakan untuk mendeteksi retrovirus eksogen avian (termasuk virus leukosis avian) setelah amplifikasi DF1. Untuk deteksi spesifik virus leukosis avian, beberapa uji titik akhir dapat digunakan seperti immunostaining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) atau complement fixation for avian leucosis (COFAL). Sel kontrol atau telur kontrol memenuhi syarat jika tidak ditemukan virus leukosis avian.

Uji virus spesifik tertentu dengan teknik amplifikasi asam nukleat Berdasarkan analisis risiko yang terkait dengan proses pembuatan, setiap lot virus dan setiap panenan virus dapat diuji dengan teknik amplifikasi asam nukleat <1389> untuk virus spesifik yang tidak terdeteksi oleh uji in vivo konvensional atau kultur sel.

Uji virus menggunakan metode molekuler luas Melalui persetujuan instansi berwenang, metode molekuler yang luas (misalnya high-throughput sequencing) dapat digunakan baik sebagai alternatif untuk uji in vivo dan Teknik Amplifikasi Asam Nukleat spesifik, atau sebagai suplemen/alternatif untuk uji kultur in vitro berdasarkan analisis risiko. Baik Teknik Amplifikasi Asam Nukleat <1389> dan metode molekuler luas dilakukan dengan atau tanpa amplifikasi sebelumnya dalam sel yang sesuai. Dalam kasus hasil positif dengan metode molekuler luas atau Teknik Amplifikasi Asam Nukleat, pemeriksaan lebih lanjut harus dilakukan untuk menentukan apakah asam nukleat yang terdeteksi disebabkan oleh adanya infeksi agens asing dan/atau diketahui memiliki risiko terhadap kesehatan manusia.