tambahan monografi
VAKSIN RABIES
Rabies Vaccine

Vaksin rabies untuk manusia disiapkan dalam biakan sel pada sediaan beku kering dari galur virus rabies yang sesuai yang ditumbuhkan dalam biakan sel dan diinaktivasi dengan metode tervalidasi.

Vaksin direkonstitusi sesaat sebelum digunakan, seperti tertera pada label, untuk menghasilkan larutan jernih yang dapat berwarna jika terpapar indikator pH.

PRODUKSI
Produksi vaksin berdasarkan pada sistem lot benih dan sistem bank sel jika virus dipropagasi dalam sel diploid manusia. Metode produksi harus dapat menghasilkan vaksin rabies dengan imunogenisitas, keamanan, dan stabilitas yang memadai secara konsisten. Kecuali telah dijustifikasi dan disetujui, pasase virus dalam produk akhir lot benih induk tidak boleh lebih dari virus yang digunakan untuk membuat vaksin yang sudah terbukti khasiat dan keamanannya dalam studi klinis; namun kelebihan jumlah pasase dari yang digunakan dalam uji klinik tidak boleh lebih dari 5 pasase. Metode produksi divalidasi untuk menunjukkan bahwa produk akan memenuhi Uji toksisitas abnormal <252> untuk imunosera dan vaksin untuk penggunaan manusia.

Substrat untuk Propagasi Virus Virus dipropagasi dalam sel diploid manusia seperti tertera pada Substrat sel untuk produksi vaksin manusia <1412> atau dalam biakan sel embrio ayam yang berasal dari Sekelompok ayam bebas patogen spesifik untuk produksi dan pengawasan mutu vaksin <1411>.

LOT BENIH
Galur virus rabies harus diidentifikasi berdasarkan catatan sejarah yang mencantumkan informasi mengenai asal mula galur dan proses-proses rekayasa selanjutnya. Lot benih kerja disiapkan tidak melewati lebih dari 5 pasase dari lot benih induk. Hanya lot benih kerja yang memenuhi syarat yang digunakan untuk propagasi.

Identifikasi Setiap lot benih kerja diidentifikasi sebagai virus rabies menggunakan antibodi spesifik.

Konsentrasi virus Konsentrasi virus dari lot benih kerja ditetapkan menggunakan metode biakan sel dengan imunofluoresensi, untuk menjamin konsistensi produksi.

Agens asing <72> Lot benih kerja memenuhi syarat lot benih untuk vaksin virus. Jika virus telah dilakukan pasase pada otak tikus, dilakukan uji spesifik untuk virus murine.

PROPAGASI VIRUS DAN PANENAN
Semua proses bank sel dan biakan sel turunannya dilakukan dalam kondisi aseptik pada area di mana tidak ada sel lain yang ditangani selama pembuatan. Serum hewan yang sesuai dapat digunakan dalam media biakan, tetapi media akhir untuk mempertahankan pertumbuhan sel selama propagasi virus tidak boleh mengandung serum hewan. Media mungkin mengandung albumin manusia.

Serum dan tripsin yang digunakan dalam pembuatan suspensi sel dan media harus bebas dari agens asing hidup. Media biakan sel dapat mengandung indikator pH seperti merah fenol dan antibiotik yang sesuai dengan kadar efektif terendah. Tidak kurang dari 500 mL biakan sel yang digunakan untuk produksi vaksin dipisahkan sebagai biakan sel yang tidak diinfeksi (sel kontrol); Suspensi virus dipanen pada satu atau lebih kesempatan selama inkubasi. Panen berturut-turut dari produksi biakan sel yang sama dapat dikumpulkan dan dianggap sebagai panenan tunggal. Hanya panenan virus tunggal yang memenuhi syarat berikut ini dapat digunakan pada pembuatan panenan virus inaktif.

Identifikasi Panenan tunggal diidentifikasi sebagai virus rabies menggunakan antibodi spesifik.

Konsentrasi virus Titrasi virus infektif dalam biakan sel; titer digunakan untuk memonitor konsistensi produksi.

Sel kontrol Sel kontrol dari produksi biakan sel dimana panenan tunggal yang diperoleh memenuhi uji identifikasi dan Agens asing <72>.

PEMURNIAN DAN INAKTIVASI
Panenan virus dapat dimurnikan dengan metode yang sesuai; panenan virus diinaktivasi dengan metode yang divalidasi pada tahap proses yang tetap dan terdefinisi dengan baik, yang mungkin sebelum, selama atau setelah konsentrasi atau pemurnian apa pun. Untuk memastikan bahwa proses inaktivasi virus efektif, kondisi yang dapat menyebabkan agregasi virus harus dihindari pada langkah proses sebelum inaktivasi virus. Setiap agregat yang ada dalam persiapan inaktivasi virus harus dihilangkan segera sebelum proses inaktivasi, misalnya dengan metode filtrasi yang sesuai. Harus ditunjukkan dalam studi validasi proses bahwa proses inaktivasi dilakukan secara efektif dalam inaktivasi virus rabies sehingga menjamin aktivitas perlindungan imunogenik yang konsisten.

Konsistensi harus didasarkan pada:

1.) Kinetika inaktivasi ditunjukkan konsisten menggunakan setidaknya 5 bets berturut-turut. Virus uji, dikumpulkan pada waktu yang tepat, diinokulasi ke dalam substrat yang sensitif untuk menetapkan kurva inaktivasi. Jika perlu, zat yang digunakan untuk inaktivasi dinetralkan sebelum inokulasi. 

2.) Waktu yang dibutuhkan untuk mencapai inaktivasi lengkap ditetapkan untuk menentukan waktu inaktivasi yang diperlukan. Uji untuk sisa virus infektif digunakan untuk tujuan ini. Total waktu inaktivasi yang digunakan dalam produksi rutin harus setidaknya dua kali dari waktu yang diperlukan untuk inaktivasi virus lengkap.

Jika betapropiolakton digunakan, konsentrasi pengenceran 1:3500 – 1:5000 selama 24 jam atau hingga inaktivasi selesai. Hanya suspensi virus inaktif yang memenuhi syarat berikut ini dapat digunakan untuk pembuatan vaksin ruahan akhir.

Residu virus infektif Lakukan uji amplifikasi untuk residu virus rabies infektif segera setelah inaktivasi atau menggunakan sampel yang dibekukan segera setelah inaktivasi dan disimpan pada -70°. Inokulasi sejumlah suspensi virus inaktif yang setara dengan tidak kurang dari 25 mL vaksin ruahan yang sesuai dengan setidaknya 25 dosis vaksin manusia ke dalam biakan sel dengan tipe yang sama seperti yang digunakan untuk produksi vaksin atau jenis sel lain yang disetujui. Sel yang digunakan untuk uji harus memiliki sensitivitas optimal terhadap residu virus rabies infektif, contoh: sel vero, BHK-21 atau sel neuroblastoma yang diketahui sangat sensitif terhadap virus rabies yang digunakan. Jika sel lain digunakan, sel tersebut harus terbukti memiliki setidaknya sensitivitas yang sama dengan yang ditentukan. Pasase dapat dibuat setelah 7 hari. Pertahankan biakan selama 21 hari dan kemudian periksa biakan sel untuk virus rabies menggunakan uji imunofluoresensi atau metode lain yang sesuai dengan sensitivitas yang sebanding. Panenan virus inaktif memenuhi syarat jika virus rabies inaktif tidak terdeteksi.

Residu DNA sel inang Tidak lebih besar dari 10 ng per dosis tunggal manusia. Jika lini sel lestari digunakan untuk propagasi virus, kandungan residu DNA sel inang ditentukan dengan metode yang sesuai.

VAKSIN RUAHAN AKHIR
Vaksin ruahan akhir dibuat dari satu atau lebih suspensi virus inaktif. Stabilisator yang disetujui dapat ditambahkan untuk menjaga aktivitas produk selama dan setelah beku kering. Hanya vaksin ruahan akhir yang memenuhi syarat berikut ini digunakan dalam pembuatan lot akhir.

Kandungan glikoprotein Kandungan glikoprotein ditetapkan menggunakan Metode imunokimia yang sesuai <1385>. Contoh: Single radial immunodiffusion (SRID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) atau uji ikatan antibodi. Kandungan glikoprotein dalam produk tertentu harus dalam batas yang disetujui oleh yang berwenang.

Sterilitas <71> Memenuhi syarat. Gunakan 10 mL untuk setiap media.

LOT AKHIR
Vaksin ruahan akhir didistribusikan ke dalam wadah steril dan dibekukeringkan sehingga kandungan kelembapan sesuai untuk stabilitas produk. Wadah kemudian ditutup untuk menghindari kontaminasi dan masuknya uap air.

Hanya lot akhir yang memenuhi syarat unit viabilitas dan Identifikasi, Uji Batas, dan Penetapan potensi dapat diluluskan untuk penggunaan. Jika penetapan serum albumin sapi pada vaksin ruahan akhir telah dilakukan dengan hasil yang memenuhi syarat, penetapan ini dapat dihilangkan pada lot akhir.

IDENTIFIKASI
Vaksin dinyatakan mengandung antigen virus rabies menggunakan Metode imunokimia yang sesuai <1385> menggunakan antibodi spesifik, terutama antibodi monoklonal; atau dapat digunakan Penetapan potensi.

Kandungan glikoprotein Kandungan glikoprotein ditetapkan menggunakan Metode imunokimia yang sesuai <1385>. Contoh: Single radial immunodiffusion (SRID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) atau uji ikatan antibodi. Kandungan glikoprotein dalam produk tertentu berada dalam batas yang disetujui oleh pihak yang berwenang.

Serum Albumin Sapi Mengandung tidak lebih dari 50 ng serum albumin sapi per dosis tunggal manusia. Gunakan Metode imunokimia yang sesuai.<1385>.

Sterilitas <71> Memenuhi syarat.

Endotoksin Bakteri <201> Tidak lebih dari 25 IU per dosis tunggal manusia.

Pirogen <231> Memenuhi syarat, suntikkan 1,0 mL dosis tunggal manusia yang diencerkan hingga 10-100 kali volume pada tiap kelinci. Uji ini dilakukan apabila terdapat zat pirogenik non-endotoksin.

Air <1031> Mengandung tidak lebih dari 3,0% air.

PENETAPAN POTENSI
Potensi vaksin rabies ditetapkan dengan membandingkan dosis yang diperlukan untuk melindungi mencit terhadap efek dari dosis letal virus rabies, yang diberikan secara intraserebral, dengan sejumlah sediaan baku vaksin rabies yang diperlukan untuk memberikan perlindungan yang sama. Untuk perbandingan ini, sediaan baku vaksin rabies dikalibrasi dalam Unit Internasional, dan persiapan virus rabies yang sesuai untuk digunakan pada uji tantang. Sebagai alternatif, untuk kenyamanan hewan, uji potensi serologi atau Metode imunokimia yang tervalidasi <1385> untuk kandungan glikoprotein direkomendasikan.

Metode alternatif divalidasi terhadap uji tantang dan disetujui oleh instansi yang berwenang.

Uji tantang di bawah ini menggunakan model garis paralel minimal 3 titik untuk vaksin yang akan diuji dan persiapan baku. Analis yang berkompeten dapat melakukan uji sederhana menggunakan pengenceran tunggal vaksin uji dan pembanding. Uji tersebut untuk menentukan bahwa vaksin memiliki potensi yang secara signifikan lebih tinggi dari minimum yang dipersyaratkan, namun tidak memberikan informasi lengkap tentang validitas setiap potensi penentuan individu. Penggunaan pengenceran tunggal memungkinkan pengurangan jumlah hewan yang diperlukan untuk pengujian.

Seleksi dan distribusi hewan uji Gunakan mencit betina sehat umur 4 minggu dengan bobot antara 11-15 g. Distribusikan mencit pada 6 kelompok dengan jumlah yang sesuai untuk memenuhi persyaratan validitas uji dan 4 kelompok masing-masing 5 mencit untuk titrasi suspensi tantang.

Persiapan suspensi tantang Inokulasi mencit secara intraserebral dengan Challenge Virus Standard (CVS) galur virus rabies dan ketika mencit menunjukkan tanda rabies, dieutanasia, kemudian ambil otak dan siapkan homogenat dari jaringan otak dalam pengencer yang sesuai. Pisahkan partikulat kotor dengan sentrifugasi dan gunakan beningan sebagai suspensi tantang.

Distribusikan suspensi dalam volume kecil pada ampul, segel dan simpan pada suhu di bawah -60°. Cairkan 1 ampul suspensi dan buat pengenceran serial dengan pengencer yang sesuai.

Suntikkan sejumlah 0,03 mL CVS secara intraserebral pada 5 mencit di tiap kelompok. Amati mencit selama 14 hari. Hitung LD₅₀ dari suspensi yang tidak diencerkan menggunakan jumlah hewan mati atau menunjukkan tanda rabies di setiap kelompok, antara hari ke 5 dan 14.

PENETAPAN POTENSI
Siapkan 3 seri pengenceran kelipatan lima dari masing-masing vaksin uji dan 3 seri pembanding vaksin. Siapkan pengenceran sedemikian rupa sehingga suspensi paling pekat dapat melindungi lebih dari 50% hewan dan suspensi yang paling encer dapat melindungi kurang dari 50% hewan. Suntikkan secara intraperitoneal sebanyak 0,5 mL dari 6 seri pengenceran, 1 untuk masing-masing dari 6 kelompok mencit. Setelah 7 hari, siapkan 3 pengenceran yang sama dari vaksin uji dan pembanding vaksin dan ulangi injeksi. 7 hari setelah injeksi kedua, siapkan suspensi virus tantang berdasarkan titrasi awal, 0,03 mL mengandung sekitar 50 LD50. Suntikkan 0,03 mL vaksin secara intraserebral pada setiap mencit yang divaksinasi. Amati mencit pada tiap kelompok selama 14 hari, catat jumlah hewan mati atau menunjukkan tanda rabies di setiap kelompok pada hari ke 5 sampai hari ke 14 setelah tantang.

Pengujian memenuhi syarat jika (1) vaksin uji dan pembanding vaksin pada rentang enceran dosis paling pekat dan paling encer dapat melindungi 50% mencit (2) Titrasi suspensi tantang menunjukkan pada 0,03 mL suspensi mengandung tidak kurang dari 10 LD50; (3) Analisis statistik kurva dosis respons dinyatakan paralel apabila menunjukkan kemiringan yang signifikan dan tidak menunjukkan adanya penyimpangan yang bermakna pada linieritas; (4) Batas kepercayaan (P=0,95) tidak kurang dari 25% dan tidak lebih dari 400% dari estimasi potensi. Vaksin memenuhi syarat jika potensi tidak kurang dari 2,5 IU per dosis tunggal manusia.

Penerapan titik akhir alternatif Setelah laboratorium menetapkan uji di atas untuk penggunaan rutin, titik akhir letal digantikan oleh pengamatan tanda klinis dan penerapan titik akhir lebih awal dari kematian untuk mengurangi penderitaan hewan. Progres infeksi rabies pada mencit setelah disuntik secara intraserebral dapat diwakili oleh 5 tahap yang memiliki gejala klinis yang khas seperti:

Tahap 1 : Bulu yang acak-acakan, membungkuk ke belakang 

Tahap 2 : Pergerakan lambat, kehilangan keseimbangan (gerakan memutar juga dapat terjadi) 

Tahap 3 : Gerakan goyah, gemetar, kejang-kejang 

Tahap 4 : Tanda paresis atau paralisis; 

Tahap 5 : Keadaan hampir mati

Mencit diamati setidaknya 2 kali sehari mulai hari ke 4 setelah tantang. Gejala klinis dicatat menggunakan Tabel 1 Berdasarkan hasil penelitian, pada hasil akhir pengujian penetapan tahap 3 sebagai titik akhir setara dengan jika menggunakan metode lethal end-point. Setiap laboratorium harus melakukan verifikasi untuk penetapan nilai scoring menggunakan gejala klinis dan lethal end-point.

Tabel 1 

Contoh tabel yang digunakan untuk mencatat gejala klinis pada penetapan potensi vaksin rabies.

PENANDAAN Cantumkan sumber biologik sel yang digunakan untuk membuat vaksin.