Kapasitas vaksin untuk menginduksi pembentukan antibodi spesifik pada mencit atau marmot dibandingkan dengan kapasitas yang sama dari sediaan baku yang diuji secara paralel; antibodi ditentukan dengan metode imunokimia <1385> yang sesuai seperti Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Vaksin kombinasi yang mengandung komponen pertusis dengan komponen difteri dan tetanus, dilakukan uji serologi pada marmot dengan kelompok hewan yang sama yang digunakan untuk uji serologis Vaksin Jerap Difteri dan Vaksin Jerap Tetanus ketika kondisi imunisasi umum untuk semua komponen (misalnya, dosis, durasi) telah dibuktikan valid untuk vaksin kombinasi.
Model marmot yang digunakan memungkinkan pengurangan lebih lanjut dalam jumlah hewan yang dibutuhkan dan harus dipertimbangkan oleh setiap analis sesuai dengan ketentuan yang ditetapkan oleh instansi yang berwenang.
Metode A dan B yang dijelaskan di bawah ini menggunakan pengenceran berseri untuk sediaan uji dan baku.
Setelah validasi untuk vaksin tertentu, dimungkinkan untuk menerapkan model yang disederhanakan seperti pengenceran tunggal untuk sediaan uji dan baku. Model seperti itu memungkinkan analis untuk menentukan apakah imunogenisitas dari sediaan uji sebanding dengan vaksin baku, tetapi tidak memberikan informasi tentang linieritas atau paralelisme respon kurva dosis.
Untuk pengujian serologis, indikator yang sesuai untuk memantau konsistensi pengujian adalah:
Jika uji pengenceran tunggal digunakan, produksi dan konsistensi uji dari waktu ke waktu dipantau melalui indikator yang sesuai dan dengan melakukan uji pengenceran berseri secara berkala, misalnya setiap 2 tahun.
METODE A. Serologi pada mencit
Seleksi dan distribusi hewan uji
Gunakan mencit yang sehat dari stok yang sama, sekitar umur 5 minggu. Bagikan hewan dalam 6 kelompok dengan nomor yang sesuai dengan persyaratan pengujian. Gunakan 3 pengenceran vaksin uji dan 3 pengenceran baku vaksin. Suntikkan 0,5 mL tiap pengenceran secara intraperitoneal atau subkutan ke setiap mencit yang diberikan ke setiap kelompok. Selama studi validasi, dapat digunakan kelompok mencit sebagai kontrol negatif dengan menyuntikkan pengencer.
Baku Vaksin Vaksin terbukti efektif dalam uji klinis atau perwakilan bets digunakan sebagai baku vaksin. Persiapan bets yang representatif, diperlukan persyaratan pada proses produksi yang digunakan untuk bets yang diuji dalam uji klinis. Stabilitas baku vaksin harus dipantau dan didokumentasikan.
Baku Antiserum Baku antiserum dari aktivitas yang ditetapkan digunakan dalam uji dan berfungsi sebagai dasar untuk penghitungan kadar antibodi dalam uji serum. Bordetella pertussis mouse antiserum BRP yang sesuai digunakan sebagai baku antiserum. Model pengujian berikut diberikan sebagai contoh metode yang telah terbukti memberikan hasil yang valid.
Pengumpulan sampel serum 4-5 minggu setelah vaksinasi, ambil darah tiap mencit yang telah dianastesi. Simpan serum pada -20° sampai digunakan untuk penentuan antibodi.
Penentuan antibodi Uji serum individu untuk kandungan antibodi spesifik untuk setiap antigen pertusis aseluler menggunakan metode yang tervalidasi seperti uji ELISA yang ditunjukkan di bawah ini.
Uji Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Lempeng mikrotiter (poli(vinil klorida) atau polistiren yang sesuai untuk antigen tertentu) dilapisi dengan antigen yang dimurnikan pada konsentrasi 100 ng per sumur. Setelah pencucian, diblok dengan menginkubasi lempeng dengan larutan albumin serum P kemudian dicuci. Pengenceran serum 2 kali lipat dari mencit individu yang diimunisasi dengan vaksin uji atau baku dibuat di atas lempeng. Antiserum baku disertakan di setiap lempeng. Setelah inkubasi pada 22-25° selama 1 jam, lempeng dicuci. Larutan enzim antibodi anti-mouse IgG terkonjugasi yang sesuai ditambahkan pada setiap lempeng dan diinkubasi pada 22-25° selama 1 jam. Setelah pencucian, substrat kromogenik ditambahkan dari konjugat enzim terikat melepaskan kromofor yang dapat diukur serapannya seperti tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya <1191>.
Perhitungan
Titer antibodi dalam serum mencit yang diimunisasi dengan vaksin baku dan uji dihitung untuk setiap antigen pertusis aseluler menggunakan antiserum baku, dari nilai yang diperoleh, potensi relatif vaksin uji dengan vaksin baku dihitung dengan metode statistik. Pengujian valid jika:
METODE B. Serologi pada marmot
Seleksi dan distribusi hewan uji
Gunakan marmot yang sehat dari stok yang sama dengan bobot 250-350 g. Gunakan marmot dengan jenis kelamin yang sama, atau jantan dan betina yang didistribusikan secara merata di antara kelompok. Distribusikan marmot tidak kurang dari 6 kelompok yang sama, gunakan kelompok yang berisi sejumlah hewan yang cukup untuk mendapatkan hasil yang memenuhi persyaratan uji valid yang ditentukan di bawah ini. Selama studi validasi, dapat digunakan kelompok marmot sebagai kontrol negatif dengan menyuntikkan pengencer
Baku Vaksin Vaksin terbukti efektif dalam uji klinis atau perwakilan bets digunakan sebagai baku vaksin. Persiapan bets yang representatif, diperlukan persyaratan pada proses produksi yang digunakan untuk bets yang diuji dalam uji klinis. Stabilitas baku vaksin harus dipantau dan didokumentasikan
Baku Antiserum Baku antiserum marmot dari aktivitas yang ditetapkan digunakan dalam uji dan berfungsi sebagai dasar untuk penghitungan kadar antibodi dalam uji.
Persiapan pengenceran sediaan uji dan baku Gunakan larutan natrium klorida P 9 g per L sebagai pengencer, siapkan seri pengenceran vaksin untuk diuji dan sediaan baku; seri yang berbeda dengan 2,5-5 kali lipat telah terbukti sesuai. Gunakan tidak kurang dari 3 pengenceran dalam kisaran yang dianggap sesuai untuk semua komponen dalam vaksin yang akan diuji. Gunakan pengenceran untuk imunisasi sebaiknya dalam 1 jam setelah persiapan. Alokasikan 1 pengenceran untuk setiap kelompok marmot
Imunisasi Suntikkan 1,0 mL pengenceran secara subkutan ke setiap marmot yang diberikan ke kelompoknya.
Pengumpulan sampel serum 35-42 hari (5-6 minggu) setelah vaksinasi, ambil sampel darah dari tiap marmot yang divaksinasi dan marmot kontrol negatif dengan menggunakan metode yang sesuai. Simpan serum pada -20° sampai digunakan untuk penentuan antibodi. Hindari pembekuan dan pencairan sampel serum yang terlalu sering.
Penentuan antibodi Uji serum individu untuk kandungan antibodi spesifik untuk setiap antigen pertusis aseluler menggunakan metode yang divalidasi seperti uji ELISA yang ditunjukkan di bawah ini.
Uji Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Lempeng mikrotiter 96-sumur yang sesuai dilapisi dengan antigen yang dimurnikan (misalnya, toksin pertusis (PT), pertaktin (PRN), filamentous haemagglutinin (FHA) dan/atau fimbrial agglutinogens (Fim2/3)) yang mewakili komponen dalam vaksin gabungan dengan konsentrasi 200-400 ng per sumur. Setelah pencucian, diblok dengan menginkubasi lempeng dengan larutan Dapar yang sesuai kemudian dicuci. Pengenceran serum 2 kali dari marmot individu yang diimunisasi dengan vaksin uji atau baku dibuat di atas lempeng. Setelah diinkubasi pada 37° selama 1 jam, lempeng dicuci. Larutan enzim antibodi IgG anti-marmot terkonjugasi yang sesuai ditambahkan pada setiap lempeng dan diinkubasi pada 37° selama 1 jam. Setelah pencucian, substrat kromogenik ditambahkan dari konjugat enzim terikat melepaskan kromofor yang dapat diukur serapannya seperti tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya <1191>.
Perhitungan Titer antibodi dalam serum marmot yang diimunisasi dengan vaksin baku dan uji dihitung untuk setiap antigen pertusis aseluler menggunakan baku antiserum, dan dari nilai yang diperoleh, potensi relatif vaksin uji dengan vaksin baku dihitung dengan metode statistik. Pengujian valid jika:
Metode B. Penentuan Antibodi pada Marmot
Metode ELISA yang ditunjukkan di bawah ini diberikan sebagai contoh metode imunokimia yang telah terbukti sesuai.
Penentuan titer antibodi menggunakan metode ELISA untuk toksin pertusis (PT), filamentous haemagglutinin (FHA), fimbrial agglutinogens (Fim2/3) dan pertaktin (PRN)
Pengenceran serum 2 kali dari vaksin uji dan baku dibuat pada lempeng ELISA yang dilapisi dengan antigen pertusis aseluler (PRN, PT, FHA atau Fim 2/3). Baku antiserum marmot dan serum marmot negatif disertakan di setiap lempeng. Ditambahkan antibodi kelinci atau kambing yang terkonjugasi peroksidase terhadap IgG marmot, diikuti oleh substrat peroksidase. Optical density diukur dan titer antibodi relatif dihitung dengan metode statistik. Reagen dan Peralatan:
Metode
Metode dibawah ini digunakan sebagai contoh metode yang sesuai, tetapi metode lain dapat digunakan.
Sumur 1 A-H digunakan untuk serum negatif kontrol. Sumur 2-12 A-H digunakan untuk antiserum baku marmot (biasa dalam 2 posisi) dan serum individu dari marmot diimunisasi dengan vaksin uji atau vaksin baku.
Lapisi tiap sumur lempeng ELISA dengan 100 μL larutan antigen yang sesuai (PT, FHA dan Fim 2/3 pada 2 μg/mL dan PRT pada 4 μg/mL dalam dapar pelapis karbonat pH 9,6). Diamkan semalaman pada 4° dalam suasana lembab. Untuk menghindari efek gradien suhu, jangan menumpuk lebih dari 4 lempeng. Keesokan harinya, cuci lempeng sampai bersih dengan dapar pencuci. Blok lempeng dengan penambahan 150 μL Dapar pemblok ke setiap sumur. Inkubasi dalam suasana lembab pada 37° selama 1 jam. Cuci lempeng sampai bersih dengan dapar pencuci. Tempatkan 100 μL Dapar pemblok di setiap sumur pada lempeng kecuali baris A. Siapkan pengenceran yang sesuai dari uji individu dan sampel serum baku vaksin, baku antiserum dan sampel serum kontrol negatif. Alokasikan serum kontrol negatif ke kolom 1, baku antiserum ke setidaknya 2 kolom lain dan uji individu dan serum baku vaksin ke kolom yang tersisa dan tambahkan 100 μL dari setiap serum ke 2 sumur pertama dari kolom yang dialokasikan. Dengan menggunakan mikropipet multichannel, buat seri pengenceran 2 kali dari baris B ke bawah lempeng ke baris H, dengan mentransfer 100 μL dari satu sumur ke sumur berikutnya. Buang 100 μL dari baris terakhir sehingga semua sumur berisi 100 μL. Inkubasi pada 37° selama 2 jam. Cuci lempeng sampai bersih dengan dapar pencuci. Siapkan pengenceran konjugat peroksidase yang sesuai dalam Dapar pemblok dan tambahkan 100 μL ke setiap sumur. Inkubasi dalam suasana lembab pada 37° selama 1 jam. Cuci lempeng sampai bersih dengan dapar pencuci. Tambahkan 100 μL substrat peroksidase ke tiap sumur. Biarkan pada suhu ruang, terlindung dari cahaya selama 30 menit. Baca lempeng pada 405 nm dalam urutan yang sama dengan penambahan substrat.