RESIDU TOKSIN PERTUSIS <1413>

Uji residu toksin pertusis dilakukan secara in vitro, menggunakan sel Chinese Hamster Ovary (CHO), untuk pengujian komponen pertusis murni yang tidak teradsorpsi.

Baku Pembanding Toksin Pertusis Baku Pembanding.

Uji pengelompokan sel CHO didasarkan pada induksi cluster dalam kultur sel CHO non-konfluen oleh toksin pertusis aktif. Kultur diperiksa dengan mikroskop dan hitung setiap kelompok yang ada. Penetapan kadar dapat digunakan sebagai uji kuantitatif atau sebagai uji batas dengan sensitivitas yang ditentukan dalam setiap pengujian menggunakan pengenceran sediaan Toksin Pertusis Baku Pembanding.

Sensitivitas uji CHO terhadap toksin pertusis diverifikasi dengan Toksin Pertusis Baku Pembanding atau baku pembanding yang dikalibrasi dalam Unit Internasional menggunakan uji CHO yang sesuai. Sensitivitas uji didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dalam seri pengenceran baku pembanding untuk menghasilkan respons positif, yaitu tidak kurang dari 10 cluster sel CHO. Uji yang sesuai memiliki sensitivitas minimal 5 mUI per mL.

Metode dibawah ini digunakan sebagai contoh Pereaksi dan peralatan Toksin Pertusis Baku Pembanding, lini sel CHO-K1 (ATCC No. CCL-61 atau ECACC No. 85051005), Media Kaighn's modified Ham's F-12K.

Media yang komposisinya sedikit berbeda dari Tabel 1 dapat digunakan. Prolin adalah komponen penting dari media. Bila perlu, atur pH hingga 7,2 ± 0,2.

Tabel 1. Media Kaighn's modified Ham's F-12K

• Media kultur sel CHO Tambahkan media Kaighn's modified Ham's F-12K dengan serum foetal bovine untuk mendapatkan konsentrasi akhir 10% v/v. Tambahkan larutan 0,2 M L-glutamin secukupnya untuk mendapatkan konsentrasi akhir 1% v/v. Jika perlu dapat ditambahkan larutan antibiotik/antimikotik. Jika perlu, atur pH hingga 7,2 ± 0,2. Simpan pada suhu 5° ± 3° selama maksimal 3 minggu, terlindung dari cahaya.
• Larutan tripsin-EDTA (tripsin 0,25%). 
• Dapar salin fosfat pH 7,4, tanpa kalsium atau magnesium. Larutkan 9,0 g Natrium klorida P, 0,144 g Kalium dihidrogen fosfat P dan 0,795 g Dinatrium hidrogen fosfat heptahidrat P dalam air. Encerkan hingga 1000,0 mL dengan pelarut yang sama. Jika perlu, atur pH. 
• Plat tetes dengan 24 sumur 
• Labu kultur jaringan 75 cm2. f. Tabung mikro polipropilen pengikat protein rendah.

Kultur Sel CHO Sel diperoleh dari bank sel dan digunakan di antara tingkat pasase yang ditentukan. Sel CHO dikultur dalam labu kultur jaringan yang berisi 20 mL media kultur sel CHO dalam inkubator yang dilembabkan, diatur pada suhu 37° dan 5% CO2. Sel dilewatkan pada rasio 1:5 hingga 1:20 saat mendekati pertemuan. Sebelum digunakan, biarkan semua pereaksi mencapai suhu ruang atau hangatkan hingga 37°.

Untuk melewati sel, lepaskan media kultur sel CHO. Cuci lapisan sel secara perlahan dengan membilas 2-3 kali dengan dapar salin fosfat. Buang dapar salin fosfat dan tambahkan 2 mL larutan tripsin-EDTA ke dalam labu, biarkan hingga menutupi lapisan tunggal selama 20 detik. Buang larutan tripsin-EDTA dengan pipet. Segera amati kultur menggunakan mikroskop fase kontras. Saat sel mulai berkontraksi, ketuk sisi labu kultur dengan kuat untuk mengeluarkan sel. Ketika sebagian besar sel terapung, tambahkan 10 mL media kultur sel CHO untuk menghentikan digesti tripsin. Tripsinisasi yang digunakan untuk pelepasan sel harus dikontrol dengan hati-hati untuk menghindari digesti berlebihan yang menyebabkan pembelahan reseptor toksin pertusis atau protein perlekatan sel, atau keduanya.

Tentukan konsentrasi dan viabilitas sel menggunakan eksklusi trypan blue atau metode lain yang sesuai. Untuk melanjutkan, viabilitas sel harus lebih besar dari 95%. Pindahkan suspensi sel dalam jumlah yang cukup ke dalam labu untuk rasio bagian 1:5 hingga 1:20 dan tambahkan media kultur sel CHO hingga volume menjadi 20 mL. Inkubasi sel dalam inkubator yang diatur pada suhu 37° dan 5% CO2 minimal 48 jam sebelum digunakan dalam uji CHO.

• Kepadatan pembenihan untuk uji CHO Siapkan suspensi sel CHO menggunakan prosedur tripsinisasi seperti tertera pada Kultur Sel CHO. Hitung dan encerkan suspensi sel menjadi antara 4 × 104 dan 8 × 104 sel CHO per mL dalam media kultur sel CHO. Konsentrasi sel yang dipilih harus memungkinkan cluster untuk diidentifikasi pada akhir periode stimulasi. Pipet 250 μL suspensi sel ke dalam plat tetes dengan 24 sumur. Simpan lempeng benih dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37° dan 5% CO2 sambil menyiapkan baku dan larutan uji.

Penyiapan Toksin Pertusis Baku Pembanding Rekonstitusi Toksin Pertusis Baku Pembanding seperti yang tercantum pada leaflet. Siapkan 7 seri pengenceran kelipatan dua dalam media kultur sel CHO, sehingga titik akhir penetapan kadar terjadi di tengah seri pengenceran. Pengenceran disiapkan dalam tabung mikro polipropilen pengikat protein rendah. Tiap lempeng uji harus disertai satu seri pengenceran baku pembanding.

Penyiapan komponen pertusis murni yang tidak teradsorpsi Encerkan larutan uji dalam media kultur sel CHO untuk mendapatkan konsentrasi tertinggi yang tidak mengencerkan nutrisi media secara bermakna, untuk memaksimalkan sensitivitas pengujian. Siapkan seri pengenceran seperti yang yang tertera pada Penyiapan Toksin Pertusis Baku Pembanding.

Stimulasi sel CHO Pipet 250 μL dari masing-masing tabung seri pengenceran penyiapan baku ke dalam sumur yang ditentukan dari lempeng uji yang telah berisi sel CHO. Dengan cara yang sama, pipet 250 μL dari tiap enceran larutan uji ke dalam sumur yang ditentukan. Pipet 250 μL media kultur sel CHO ke dalam sumur kontrol negatif. Kembalikan lempeng uji ke inkubator yang dilembabkan pada suhu 37° dan 5% CO2 selama 48 jam.

Skoring dan interpretasi hasil Amati kultur sel menggunakan mikroskop fase kontras pada perbesaran 4x atau 10x. Di semua sumur kultur sel tidak boleh konfluen dan harus memiliki ruang pertumbuhan yang cukup untuk memungkinkan setiap cluster yang ada dapat dihitung. Tetapkan skor positif ketika 10 atau lebih formasi cluster sel CHO terlihat jelas dalam satu sumur. Tetapkan skor negatif untuk sumur yang berisi kurang dari 10 cluster. Konsentrasi titik akhir adalah konsentrasi terendah dengan skor positif.

Validitas pengujian Pengujian valid jika :

1. sumuran kontrol negatif tidak menunjukkan bukti pengelompokan. 
2. sumur yang mengandung preparat toksin pembanding pada konsentrasi lebih besar atau sama dengan 5 mUI per mL menunjukkan respons positif (yaitu 10 atau lebih cluster sel CHO). 
3. titik akhir pengenceran yang jelas diamati untuk penyiapan baku. 
4. nilai replikasi untuk titik akhir penyiapan baku tidak berbeda lebih dari satu pengenceran kelipatan dua dalam satu pengujian.

Perhitungan Hitung aktivitas residu toksin pertusis dalam larutan uji dalam UI per mL, relatif terhadap baku pembanding, dengan menggunakan persamaan berikut:

GM (titik akhir)u dan GM (titik akhir)s berturut-turut adalah rata-rata geometrik nilai kebalikan dari pengenceran titik akhir (pengenceran terakhir dengan skor positif) untuk larutan uji dan larutan baku; As adalah aktivitas penyiapan baku dalam UI per mL.

Sebagai contoh: Seri 7 pengenceran kelipatan dua disiapkan untuk larutan baku dan larutan uji. Larutan baku memiliki aktivitas 1000 UI per mL. Skor diamati pada setiap enceran larutan baku dan larutan uji, nilai kebalikan dari titik akhir pengenceran dan rata-rata geometrik nilai kebalikan dari titik akhir pengenceran ditunjukkan pada Tabel 2 dan 3.

Tabel 2. Pengenceran dan skor Larutan baku

Tabel 3. Pengenceran dan skor Larutan uji

Aktivitas residu toksin pertusis dalam larutan uji dapat ditentukan sebagai berikut: (1131/565685) × 1000 = 2 UI per mL.