Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat masukkan ke dalam labu tentukur yang sesuai, larutkan dan encerkan dengan air sampai tanda hingga larutan mengandung polisakarida kering lebih kurang 5 mg per mL. Buat enceran larutan dengan kadar antara 30 μg dan 600 μg asetikolin klorida (O-asetil). Buat 3 larutan reaksi dengan masing-masing volume 0,3 mL, 0,5 mL dan 1,0 mL dan 3 larutan koreksi dengan masing-masing volume 0,3 ml, 0,5 ml dan 1,0 mL.
Larutan baku Larutkan 0,15 g asetilkolin klorida P dalam 10 mL air (larutan persediaan mengandung 15 g asetilkolin klorida per L). Segera sebelum digunakan, encerkan 1 mL larutan persediaan dengan air sampai 50 mL (larutan baku kerja 1 mengandung 300 μg asetilkolin klorida per mL). Segera sebelum digunakan, encerkan 1 mL larutan persediaan dengan air sampai 25 mL (larutan baku kerja 2 mengandung 600 μg asetilkolin klorida per mL).
Larutan baku kerja 1 Buat larutan reaksi 0,1 mL dan 0,4 mL dan larutan koreksi 0,1 mL dan 0,4 mL Larutan baku kerja 2 Buat larutan reaksi 0,6 mL dan 1,0 mL dan larutan koreksi 0,6 mL dan 1,0 mL.
Prosedur Siapkan blanko menggunakan 1 mL air, masukkan ke dalam tabung. Tambahkan 1,0 mL asam hidroklorida P 4 N pada tabung larutan koreksi dan blangko. Tambahkan 2,0 mL larutan alkalin hidroksilamin P ke dalam masing-masing tabung. Biarkan selama 2 menit, tambahkan 1,0 mL asam hidroklorida P 4 N ke masing-masing tabung reaksi. Tambahkan 1,0 mL larutan 100 g per L besi (III) klorida P dalam asam hidroklorida 0,1 N ke masing-masing tabung disertai penutup dan kocok kuat untuk menghilangkan gelembung udara. Ukur serapan tiap larutan pada panjang gelombang 540 nm menggunakan blangko. Untuk tiap larutan reaksi, kurangi serapan dengan larutan koreksi. Buat kurva baku dari serapan Larutan baku dan jumlah asetilkolin klorida dalam larutan uji untuk tiap volume dan hitung rata-rata dari 3 penetapan
1 mol asetilkolin klorida (181,7 g) setara dengan 1 mol O-asetil (43,05 g)