Kandungan toksin atau toksoid dalam zat dapat dinyatakan sebagai nilai flokulasi (Lf) yang ditentukan menggunakan Ramon assay. Dalam pengujian ini, antitoksin dengan konsentrasi bertingkat ditambahkan ke dalam sejumlah tabung yang berisi toksin atau toksoid dengan konsentrasi yang sama. Pada titik ekivalen toksin atau toksoid dan antitoksin, flokulasi terjadi dalam satu tabung atau lebih. Tabung pertama yang menunjukkan terjadinya flokulasi digunakan untuk menentukan nilai Lf larutan uji.
Nilai Lf toksin atau toksoid ditentukan oleh jumlah unit antitoksin yang ketika dicampur dengan larutan uji, menghasilkan campuran flokulasi yang optimal (Ramon assay).
Antitoksin yang digunakan untuk Ramon assay harus dikalibrasi langsung terhadap baku internasional untuk toksoid difteri atau baku internasional untuk toksoid tetanus untuk uji flokulasi, menggunakan prinsip-prinsip yang dijelaskan di bawah ini. Konsentrasi dinyatakan dalam Lf-ekuivalen per mL (Lf-eq/mL).
Nilai 1 Lf adalah jumlah toksin atau toksoid yang berflokulasi dalam waktu tersingkat dengan 1 Lf-eq antitoksin spesifik. Sejumlah volume baku antitoksin dengan konsentrasi 100 Lf-eq/mL dimasukkan ke dalam sederet tabung flokulasi dengan diameter 1 cm dengan jumlah bertingkat, sebagai contoh 0,40; 0,45; 0,50; 0,55; 0,60; 0,65 mL. Tambahkan larutan Natrium klorida P 0,9 % ke dalam setiap tabung sehingga diperoleh volume total 1 mL. Ke dalam masing-masing tabung tersebut tambahkan 1 mL larutan uji dengan konsentrasi 50 Lf per mL.
Kocok tabung kemudian masukkan ke dalam tangas air pada suhu konstan antara 30° dan 52°, dan amati secara berkala hingga muncul flok pertama. Gunakan lensa pembesar dan pencahayaan yang baik jika diperlukan.
Catat tabung yang menunjukkan munculnya flok pertama dan kedua dan waktu terbentuknya flok tersebut. Dua tabung dapat berflokulasi secara bersamaan.
Tabung yang pertama kali mengalami flokulasi adalah tabung yang mengandung jumlah antitoksin yang setara dengan jumlah antigen dalam larutan uji. Kandungan antitoksin dari tabung ini dapat digunakan untuk menghitung nilai Lf larutan uji. Jika 2 tabung mengalami flokulasi pada saat yang sama, maka nilai Lf larutan uji dihitung dari rata-rata kandungan antitoksin kedua tabung.
Waktu yang dibutuhkan untuk pembentukan flok pertama (Kf) menunjukkan kualitas antigen. Jika pada suhu dan konsentrasi toksoid dan antitoksin tertentu, nilai Kf meningkat dibandingkan dengan normal, ini menunjukkan bahwa antigen telah rusak. Nilai Kf juga dapat berubah dengan kualitas antitoksin yang digunakan.
Contoh:
Tabung | A | B | C | D | E | F |
Antitoksin yang ditambahkan (mL) |
0,40 |
0,45 |
0,50 |
0,55 |
0,60 |
0,65 |
Saline yang ditambahkan (mL) |
0,60 |
0,55 |
0,50 |
0,45 |
0,40 |
0,35 |
Konsentrasi Antitoksin (Lf-eq) |
40 |
45 |
50 |
55 |
60 |
65 |
Sampel hasil pengenceran yang ditambahkan |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
Jika dalam contoh di atas, tabung pertama yang mengalami flokulasi adalah tabung C, maka nilai Lf larutan uji yang diencerkan adalah 50 Lf per mL. Namun, jika tabung pertama yang mengalami flokulasi adalah tabung A atau tabung F, hal ini tidak menunjukkan kesetaraan pada tingkat tersebut. Uji ulang menggunakan larutan uji dengan pengenceran berbeda atau memilih rentang dosis baku antitoksin yang berbeda perlu dilakukan.
Presisi lebih baik dapat diperoleh dengan membuat urutan untuk flokulasi setelah tabung pertama. Jadi, dalam contoh yang tertera, jika tabung kedua yang berflokulasi adalah tabung D, nilai akhir untuk larutan uji yang diencerkan adalah 52, sedangkan jika tabung kedua yang mengalami flokulasi adalah tabung B, nilai akhir akan menjadi 48.
Jika tidak ada indikasi nilai Lf larutan uji yang diharapkan diperoleh, disarankan untuk mendapatkan perkiraan kasar menggunakan rentang kandungan antitoksin lebih lebar dalam tabung sebelum melanjutkan ke pengujian akhir.
Contoh:
Tabung | A | B | C | D | E | F |
Konsentrasi antitoksin (Lf-eq) |
20 |
30 |
45 |
70 |
100 |
150 |
Tingkat konsentrasi toksin atau toksoid dan antitoksin dalam pengujian dapat bervariasi, tetapi ini akan sangat mempengaruhi waktu flokulasi, sehingga pada tingkat yang sangat rendah, pengujian akan memakan waktu lama, sedangkan pada konsentrasi tinggi, timbulnya flokulasi mungkin sangat cepat sehingga sulit untuk membedakan tabung pertama dan kedua yang lebih dulu mengalami flokulasi.
Uji flokulasi campuran untuk konsentrasi rendah
Untuk konsentrasi yang sangat rendah, lebih baik mengukur toksin atau toksoid dengan metode flokulasi campuran. Metode ini membandingkan nilai Lf toksin atau toksoid yang diketahui dan campuran larutan uji dengan toksin atau toksoid tersebut.
Jika toksin atau toksoid dengan nilai Lf yang diketahui dan toksin atau toksoid dengan nilai Lf yang tidak diketahui berflokulasi bersama-sama, campuran akan berflokulasi pada nilai Lf yang merupakan jumlah kedua nilai Lf jika homogen. Jika toksin atau toksoid tidak homogen dicampur, akan menghasilkan pola menyimpang dengan 2 flokulasi maksimal.