Oxytocin

Oksitosin [50-56-6]

C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S₂                                         BM 1007,19

Oksitosin adalah hormon nonpeptida yang mempunyai sifat menyebabkan kontraksi otot polos uterin dan sel mioepitel kelenjar susu. Dibuat dengan cara sintesis. Aktivitas oksitosik tidak kurang dari 400 unit oksitosin FI per mg.

Baku pembanding Oksitosin BPFI; tidak boleh ditimbang. Simpan dalam lemari pembeku. Oksitosin untuk Identifikasi BPFI; Simpan dalam wadah tertutup rapat, terlidung cahaya, dalam lemari pembeku. Bersifat higroskopik.

Batas mikroba <51> Angka lempeng total tidak lebih dari 200 unit koloni per g. Uji terhadap Salmonella sp dan Escherichia coli, memberikan hasil negatif untuk produk berasal dari hewan.

Identifikasi

    A. Waktu retensi puncak oksitosin pada kromatogram Larutan uji sesuai dengan kromatogram Larutan baku yang diperoleh pada Penetapan kadar.

[Catatan Lakukan uji B atau C]

    B. Resonansi magnetik inti (Nuclear Magnetic Resonance/NMR). [Catatan Kadar oksitosin pada Larutan baku dan Larutan uji harus sama (masing-masing sekitar 5%) namun dapat diatur berdasarkan kualitas spektrum yang diperoleh. Spektrum harus diperoleh dari Larutan baku dan Larutan uji dengan kondisi yang sama. Spektrum yang diperoleh sudah memenuhi kualitas yang cukup untuk memungkinkan perhitungan integral dari resonansi spesifik. Integral dan spektrum dari kedua Larutan baku dan Larutan uji dapat diulang dan dirata-ratakan]

    Dapar natrium fosfat pH 5,0 Timbang saksama lebih kurang 27,6 g natrium fosfat monobasa P, masukkan ke dalam labu tentukur 1 L, Tambahkan 900 mL air. Atur pH hingga 5,0 ± 0,1 dengan penambahan asam fosfat P atau natrium hidroksida 10 N. Encerkan dengan air sampai tanda dan campur.

    Larutan baku Timbang saksama sejumlah Oksitosin untuk Identifikasi BPFI, larutkan dan encerkan dengan Dapar natrium fosfat pH 5,0 hingga kadar lebih kurang 10 mg per mL. Pipet 1 mL larutan ini, liofilisasi hingga kering, larutkan kembali dalam deuterium oksida P dan liofilisasi kembali, larutkan kembali dalam deuterium oksida P dan liofilisasi sekali lagi (untuk mengganti perubahan nitrogen dengan deuterium). Larutkan dalam 1 mL deuterium oksida P yang mengandung 0,5% v/v garam natrium asam propionat-(2,2,3,3-(d4)-3-(trimetilsilil)) (TSP) sebagai pembanding shift kimia.

    Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat, larutkan dan encerkan dengan Dapar natrium fosfat pH 5,0 hingga kadar lebih kurang 10 mg per mL. Pipet 1 mL larutan ini, lakukan seperti pada Larutan baku.

    Prosedur Tentukan spektrum proton NMR dari Larutan baku dan Larutan uji. Spektrum dari kedua larutan ini secara kulitatif dan kuantitatif serupa, dan semua resonansi dari spektrum Larutan baku disajikan pada spektrum Larutan uji dan mempunyai nilai shift kimia yang sama (±0,1 bpj). Identifikasi masing-masing resonansi pada spektrum Larutan uji yang tidak disajikan pada spektrum Larutan baku. Integral puncak asetat dan deuterium oksida P masing-masing 1,9 bpj dan 4,9 bpj dapat berbeda secara kuantitatif pada spektrum Larutan baku dan Larutan uji.

    C. Asam amino

    Larutan baku Siapkan larutan dengan jumlah ekimolar yang diketahui dari L-alanin, L-arginin, L-asam aspartat, L-asam glutamat, glisin, L-histidin, L-isoleusin, L-leusin, L-lisin, L-metionin, L-fenilalanin, L-prolin, L-serin, L-treonin, L-tirosin, dan L-valin dengan setengah jumlah ekimolar L-sistin. Untuk validasi metode,  gunakan baku internal yang sesuai seperti norleusin. Siapkan terpisah larutan ekimolar L-triptopan.

    Larutan uji [Catatan Kondisi hidrolisis dan kadar berikutnya dapat dimodifikasi berdasarkan metoda analisis yang dipilih].  Timbang saksama 64 mg oksitosin, masukkan ke dalam wadah yang sesuai dan larutkan dengan 1,0 mL air. Pipet 0,10 mL larutan ini ke dalam tabung hidrolisat vakum, tambahkan 2,0 mL asam hidroklorida 6 N, pindahkan tabung dan panaskan selama 16 jam pada suhu 120º. Pipet 0,10 mL hasil hidrolisis yang diperoleh ke dalam wadah yang sesuai, tambahkan 1 mL air, dan liofilisasi. Larutkan dan encerkan sampai volume tertentu dalam larutan dapar yang sesuai untuk analisis asam amino.

    Prosedur Suntikkan sejumlah volume sama Larutan baku dan Larutan uji ke dalam penganalisa asam amino, rekam dan hitung respons  masing-masing asam amino dalam mol. Hitung perbandingan relatif dari asam amino, dengan mengambil 1/6 dari jumlah mol asam aspartat, asam glutamat, prolin, glisin, isoleusin dan leusin setara dengan 1. Nilainya berada pada batas: asam aspartat 0,90-1,10; asam glutamat 0,90-1,10; prolin 0,90-1,10; glisin 0,90-1,10; leusin 0,90-1,10; isoleusin 0,90-1,10; tirosin 0,7-1,05; half-cystine 1,4-2,1. Tidak terdapat cemaran asam amino lain.

Asam asetat Antara 6% dan 10%. Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Larutan natrium hidroksida pekat Timbang saksama lebih kurang 42 g natrium hidroksida P, masukkan ke dalam labu tentukur 100-mL, larutkan dan encerkan dengan air sampai tanda.

    Larutan A Masukkan 0,7 mL asam fosfat P ke dalam 1000 mL air. Atur pH hingga 3,0 dengan penambahan  Larutan natrium hidroksida pekat.

    Larutan B Gunakan metanol P

    Fase gerak Gunakan variasi campuran Larutan A dan Larutan B seperti tertera pada Sistem kromatografi.

    Pengencer Campuran Larutan A-Larutan B (95:5).

    Larutan baku Timbang saksama sejumlah Asam asetat glasial BPFI, larutkan dan encerkan dengan Pengencer hingga kadar lebih kurang 0,1 mg per mL. [Catatan Kadar dapat diatur tergantung jumlah asetat atau asam asetat pada zat.]

    Larutan uji Timbang saksama lebih kurang 15 mg zat, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Pengencer sampai tanda.

    Sistem kromatografi Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 210 nm dan kolom 4,6 mm x 25 cm berisi bahan pengisi L1 dengan ukuran partikel 5 µm. Laju alir lebih kurang 1,2 mL per menit. Kromatograf diprogram sebagai berikut:

Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 5,0%; waktu retensi asam asetat antara 3 – 4 menit.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 10 µL) Larutan uji dan Larutan baku ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. Hitung persentase asam asetat dalam zat dengan rumus:

r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak Larutan uji dan Larutan baku; C_S adalah kadar Asam Asetat Glasial BPFI dalam mg per mL Larutan baku; C_U adalah kadar asam asetat dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan bobot yang ditimbang.

Cemaran umum Jumlah respons cemaran dalam kromatogram Larutan uji yang diperoleh dari Penetapan kadar tidak lebih dari 5% respons puncak oksitosin.

Penetapan kadar Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Larutan A Buat larutan dapar dari natrium fosfat monobasa 0,1 M.

    Larutan B Campuran asetonitril P-air (1:1), saring dan awaudarakan. Lakukan penyesuaian seperti kesesuaian sistem tertera pada Kromatografi <931>.

    Fase gerak Gunakan variasi campuran Larutan A dan Larutan B seperti tertera pada Sistem kromatografi.

    Pengencer Larutkan 5,0 g klorobutanol P dalam 5,0 mL asam asetat glasial P, tambahkan 5,0 mL etanol P, 1,1 g natrium asetat P dan 1000 mL air, campur.

    Larutan baku Larutkan seluruh isi vial Oksitosin BPFI dalam volume tertentu Pengencer. [Catatan Jika perlu larutan dapat diencerkan sampai rentang kadar yang diperlukan untuk pengujian].

    Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat uji, larutkan dalam Pengencer hingga kadar lebih kurang 10 unit Oksitosin FI per mL.

    Sistem kromatografi Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 220 nm dan kolom 4,6 mm x 12,0 cm berisi bahan pengisi L1 dengan ukuran partikel 5 µm. Pertahankan kolom pada suhu ruang, laju alir lebih kurang 1,5 mL per menit.  Kromatograf diprogram sebagai berikut:

Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara oksitosin dan puncak terdekat tidak kurang dari 1,5 dan simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 2,0% untuk oksitosin. [Catatan Atur laju alir atau komposisi Fase gerak sehingga waktu retensi oksitosin lebih kurang 10 menit dan klorobutanol antara 15 dan 17 menit.]

    Prosedur Suntikkan secara terpisah masing-masing 3 kali sejumlah volume sama (lebih kurang 100 µL) Larutan uji dan Larutan baku ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. Hitung potensi oksitosin, C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S₂, dalam unit Oksitosin FI per mg zat dengan rumus:

r_U dan r_S berturut-turut adalah nilai rata-rata dari respons puncak Larutan uji dan Larutan baku; V adalah volume Larutan uji; W adalah jumlah dalam mg oksitosin dalam Larutan uji; C adalah kadar dalam unit Oksitosin FI per mL Larutan baku.

Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat, sebaiknya dari kaca Tipe I, dalam lemari pendingin.