PENDAHULUAN

      Pengawet antimikroba adalah zat antimikroba yang ditambahkan pada sediaan farmasi non-steril bentuk larutan. Dosis pengawet yang ditambahkan adalah  untuk melindungi sediaan terhadap pertumbuhan mikroba yang ada atau yang masuk secara tidak sengaja selama ataupun sesudah proses produksi. Pada sediaan steril dosis ganda, pengawet ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba yang mungkin masuk pada pengambilan berulang. Satu jenis atau lebih pengawet diperbolehkan pada semua sediaan steril dosis ganda.

    Pengawet tidak boleh digunakan sebagai pengganti cara produksi yang baik atau semata-mata untuk menurunkan populasi mikroba viabel dari produk tidak steril atau mengendalikan bioburden pra-sterilisasi dari formulasi sediaan dosis ganda pada waktu diproduksi. Pengawet sesuai bentuk sediaan dalam farmakope memenuhi syarat untuk Bahan Tambahan dalam Ketentuan Umum.    

    Semua zat antimikroba yang digunakan bersifat toksik. Untuk melindungi konsumen secara maksimum, kadar pengawet yang efektif dalam kemasan akhir produk hendaknya di bawah tingkat toksik bagi manusia berdasarkan dosis obat yang dianjurkan. Kadar pengawet yang ditambahkan dapat dikurangi apabila bahan aktif dalam formulasi secara intrinsik mempunyai aktivitas antimikroba. Untuk semua produk injeksi dosis ganda atau produk lain yang mengandung pengawet, harus menunjukkan adanya efektivitas antimikroba baik sebagai sifat bawaan dalam produk maupun yang dibuat dengan penambahan pengawet.

    Efektivitas antimikroba juga harus ditunjukkan untuk semua produk dosis ganda berbasis air pada sediaan topikal, oral dan sediaan lain seperti tetes mata, telinga, hidung, irigasi dan cairan dialisis. Untuk pengujian, sediaan bentuk larutan dengan aktivitas air lebih dari 0,6.

    Mikroba tantang digunakan umumnya berdasarkan pada cemaran yang mungkin ada pada produk obat dengan mempertimbangkan sifat fisika, formulasi dan tujuan penggunaan. Mikroba tantang yang tercantum dalam pengujian ini tidak membatasi digunakannya mikroba spesies lain jika dianggap perlu untuk mengukur aktivitas biologi dari sistem pengawetan suatu sediaan. Mikroba tantang tambahan ini tidak masuk pembahasan dalam bab ini, tetapi mungkin dapat ditambahkan pada penjelasan mikroba uji.

PROSEDUR UMUM

    Lampiran ini dimaksudkan untuk menunjukkan efektivitas pengawet antimikroba yang ditambahkan. Pengawet antimikroba tersebut harus dinyatakan pada etiket. Prosedur dan kriteria keberterimaan pada lampiran ini hanya berlaku pada produk dalam wadah asli, bersegel, yang didistribusikan oleh produsen (lihat Tabel 1 untuk katagori produk). Uji efektivitas antimikroba tidak dilakukan pada wadah, tetapi diperlukan kehati-hatian untuk mencegah penggunaan bahan wadah yang dapat berinteraksi dengan pengawet.

PROSEDUR UJI FERTILITAS DAN KESESUAIAN METODE PEROLEHAN KEMBALI

KETENTUAN UMUM

    Kemampuan prosedur untuk mendeteksi mikroba tantang dalam sediaan uji yang telah dinetralkan harus ditetapkan. Kesesuaian prosedur harus dipastikan kembali jika ada perubahan bahan atau metode atau perubahan sediaan yang berasal dari akibat kontak langsung bahan dan berpengaruh pada hasil pengujian.

    Kemampuan media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba dalam prosedur ini juga harus ditetapkan.

PENYIAPAN GALUR UJI

    Gunakan suspensi mikroba baku atau yang disiapkan dengan teknik pemeliharaan biakan lot benih sehingga mikroba viabel untuk inokulasi tidak melebihi 5 pasase dari biakan induk. Tumbuhkan mikroba uji bakteri dan kapang secara terpisah (lihat Tabel 2).

    Gunakan biakan mikroba berikut: Candida albicans (ATCC No. 10231), Aspergillus brasiliensis (ATCC No. 16404), Escherichia coli (ATCC No. 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027) dan Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538).

    Mikroba viabel yang digunakan dalam prosedur ini sebaiknya merupakan biakan segar (sebagai contoh dalam fase pertumbuhan logaritma) kecuali untuk spora biakan A. brasiliensis. Kondisi biakan untuk biakan inokula dalam media yang sesuai yaitu Soybean-Casein Digest atau Sabouraud Dextrose Agar (lihat Tabel 2).

    Untuk memanen biakan bakteri dan C.albicans gunakan larutan salin LP steril sebagai pencuci pertumbuhan di permukaan dan kumpulkan dalam wadah steril yang sesuai. Untuk memanen spora A. brasiliensis gunakan larutan salin LP steril yang mengandung polisorbat 80 P 0,05%. Pembuatan suspensi spora sebaiknya secara aspetik misal disaring melalui wol kaca steril untuk memisahkan hifa. Seluruh suspensi mikroba sebaiknya disiapkan untuk memastikan bebas dari residu media pertumbuhan dari inokula misal disentrifus kemudian diresuspensi dalam larutan steril yang sesuai.

    Cara lain, biakan mikroba persediaan dapat ditumbuhkan dalam media cair yang sesuai misal Soybean-Casein Digest Broth atau Sabouraud Dextrose Broth, sel dipanen dengan disentrifus, dicuci dan diresuspensi dalam larutan steril yang sesuai. Suspensi mikroba yang digunakan untuk inokulasi sebaiknya diatur untuk mendapatkan jumlah mikroba lebih kurang 1 x 10⁸ koloni per mL. Gunakan suspensi bakteri dan khamir dalam waktu 2 jam atau 24 jam bila disimpan pada suhu antara 2° dan 8°. Suspensi spora yang stabil dapat disiapkan dan dipelihara pada suhu antara 2° dan 8° sampai 7 hari. [Catatan Perkiraan kadar inokula dapat dilakukan dengan pengukuran turbidimetri untuk mikroba tantang kemudian dikonfirmasi dengan angka lempeng.]

FERTILITAS MEDIA

    Media yang digunakan dalam prosedur ini harus mampu menunjang pertumbuhan mikroba. Setiap bets media jadi dan setiap bets media yang disiapkan dari media kering atau yang dibuat sendiri berdasarkan komposisi  media harus diuji.

    Untuk media padat, jumlah koloni yang ditumbuhkan harus sedikitnya 50% dari nilai perhitungan inokula yang telah dibakukan. Untuk inokula segar yang baru disiapkan, pertumbuhan mikroba sebanding dengan pertumbuhan mikroba dari bets media yang telah teruji.

KESESUAIAN METODE

PENGHITUNGAN DALAM SEDIAAN

    Siapkan pengenceran 10^-1 dengan menambahkan 1 mL sediaan (bentuk cair) pada 9 mL salin LP atau pengencer penetral lain. Lanjutkan ke tingkat pengenceran 10^-2 dan 10^-3. Tambahkan sejumlah mikroba tantang pada setiap pengenceran sediaan, campur dan kemudian tambahkan sejumlah volume yang sesuai ke dalam lempeng media untuk menghasilkan pertumbuhan kurang dari 250 koloni per lempeng bakteri dan khamir (antara 25 dan 250 koloni) atau kurang dari 80 koloni per lempeng untuk A. brasiliensis (antara 8 dan 80 koloni). Lempeng sebaiknya dilakukan minimal duplo (makin besar replikat dapat meminimalkan variabilitas perkiraan jumlah koloni). Pada prosedur ini, sebagai kontrol positif dimasukkan inokula ke dalam salin LP. Pindahkan volume salin LP yang sama tanpa inokula pada lempeng agar. Perkiraan perolehan kembali pertumbuhan koloni dari suspensi kontrol positif ini sedikitnya 50% (dari rata-rata).

    Jika sediaan yang diencerkan menunjukkan adanya antimikroba, perlu ditambahkan penetral khusus ke dalam media perolehan kembali.

    Kemampuan prosedur untuk mengukur efektivitas pengawet dapat dikompromikan jika metode mempersyaratkan kesesuaian tingkat pengenceran (10^-2 atau 10^-3) koloni perolehan kembali (misal kesulitan mengukur 3log reduksi untuk inokula 10⁵-10⁶). Jika tidak diperoleh penetral atau metode yang sesuai dan kesesuaian metode mempersyaratkan tingkat pengenceran yang nyata, maka dapat digunakan inokula tingkat kerapatan lebih tinggi (misal 10⁷-10⁸), sehingga 3log reduksi dapat diukur. Perolehan kembali tidak dapat dilaporkan kurang dari 1 koloni per lempeng dari rata-rata (atau 100 koloni per mL jika digunakan 1 mL inokula pada pengenceran 10^-2 untuk lempeng yang dibuat duplo).

    Penyaring membran dapat digunakan untuk menyaring volume pengenceran lebih besar guna mengatasi kesulitan tersebut atau menetralisasi daya antimikroba.

PENGUJIAN SEDIAAN

KATEGORI SEDIAAN

    Untuk tujuan pengujian, sediaan dibagi menjadi empat  kategori (Lihat Tabel 1). Kriteria efektivitas antimikroba untuk sediaan tergantung cara pemberiannya. Formulasi yang mengandung pengawet diharapkan dapat memenuhi standar efikasi minimal baik pada kemasan dosis ganda atau dosis tunggal.

Tabel 1. Kategori Sediaan

PROSEDUR

    Pengujian dapat dilakukan dalam tiap lima wadah asli bila volume sediaan tiap wadahnya mencukupi dan wadah sediaan dapat ditusuk secara aseptik (dengan jarum dan alat suntik melalui tutup karet elastomerik), atau dalam lima wadah bakteriologi bertutup steril, berukuran mencukupi untuk volume sediaan yang dipindahkan. Inokulasi tiap wadah dengan satu inokula baku yang telah disiapkan dan diaduk. Volume suspensi inokula yang digunakan antara 0,5% dan 1,0% dari volume sediaan untuk meminimalkan efek potensial pada sediaan. Kadar mikroba uji yang ditambahkan pada sediaan (Kategori 1, 2, atau 3) seperti halnya kadar akhir sediaan uji setelah diinokulasi antara 1 x 10⁵ dan 1 x 10⁶ koloni per mL sediaan. Untuk sediaan Kategori 4 (antasida) kadar akhir sediaan uji setelah inokulasi antara 1 x 10³ dan 1 x 10⁴ koloni per mL sediaan.

    Kadar awal mikroba viabel dalam setiap sediaan uji diperkirakan berdasarkan kadar mikroba dalam inokula baku yang ditetapkan dengan metode ALT. Inkubasi wadah yang sudah diinokulasi pada suhu 22,5º±2,5º. Ambil sampel dari setiap wadah pada interval yang sesuai seperti tertera pada Tabel 3. Amati dan catat setiap perubahan yang terjadi pada interval tersebut. Tetapkan dengan prosedur ALT jumlah koloni yang ada dari setiap sediaan uji untuk interval yang digunakan seperti tertera pada lampiran  Uji Batas Mikroba <51>. Angka Lempeng Total menggunakan replika lempeng minimal, dengan menghitung rata-rata jumlah koloni sebelum penetapan kesimpulan koloni per mL. Jika digunakan penyaring membran, lakukan duplikasi membran penyaring untuk setiap perkiraan.

    Dengan menggunakan penghitungan kadar koloni per mL pada pengujian awal, hitung perubahan nilai kadar koloni per mL dalam log₁₀ untuk tiap mikroba pada interval pengujian dan nyatakan perubahan kadar sebagai log reduksi. Log reduksi adalah perbedaan antara nilai log₁₀ koloni per mL kadar awal dalam suspensi dan log₁₀ koloni per mL yang bertahan hidup pada saat itu.

KRITERIA EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA

    Persyaratan untuk efektivitas antimikroba dipenuhi jika kriteria yang tertera pada Tabel 3 dipenuhi (Lihat Hasil Uji pada Ketentuan Umum): Tidak terjadi peningkatan lebih tinggi dari 0,5 log₁₀ unit terhadap nilai log mikroba awal.

Tabel 2. Kondisi Biakan untuk Penyiapan Inokula

Tabel 3. Kriteria untuk Mikroba Uji