PENDAHULUAN

    Teknik pemisahan kromatografi adalah metode pemisahan multi tahap dimana komponen suatu sampel didistribusikan antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan pendukung pada suatu padatan atau gel. Fase diam dapat dikemas dalam suatu kolom, menyebar sebagai suatu lapisan, didistribusikan sebagai suatu film, atau diaplikasikan oleh teknik lain. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan atau fluida superkritikal. Proses pemisahan dapat berupa suatu adsorpsi, distribusi massa (partisi), atau pertukaran ion, atau berdasarkan perbedaan antara sifat fisika kimia suatu molekul, seperti ukuran, massa dan volume. Bagian ini mencakup tentang prosedur umum, definisi dan perhitungan dari parameter umum dan menjelaskan persyaratan umum untuk kesesuaian sistem. Jenis-jenis kromatografi yang digunakan dalam prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif dalam Farmakope adalah kromatografi kolom, kromatografi gas, kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (termasuk kromatografi lapis tipis kinerja tinggi/ KLTKT), dan kromatografi cairan yang diberi tekanan atau yang biasa dikenal dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

PROSEDUR UMUM

    Bagian ini menggambarkan prosedur dasar yang digunakan ketika metode kromatografi terdapat dalam suatu monografi. Prosedur berikut ini harus diikuti kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi.

KROMATOGRAFI KERTAS

    Fase diam Merupakan lembaran kertas dengan bentuk dan ketebalan yang sesuai. Proses eluasi dapat menaik, dimana fase gerak dibawa pada kertas oleh gaya kapiler, atau menurun, dimana fase gerak merambat dengan bantuan gaya gravitasi. Arah kertas sehubungan dengan rambatan fase gerak harus dipertahankan konstan dalam serangkaian kromatogram. (Alat pengatur arah biasanya disarankan oleh pabrikan.)

    Peralatan Peralatan penting untuk kromatografi kertas terdiri dari bejana kromatografi kedap udara dengan inlet untuk memasukkan eluen dan rak dari bahan tahan korosi, 5 cm di bawah bagian dalam mulut bejana kromatografi. Rak berfungsi sebagai pendukung untuk palung pelarut dan batang untuk gantungan kertas kromatografi. Bagian bawah bejana kromatografi berisi fase gerak yang telah ditetapkan. Jenuhkan bejana dengan uap fase gerak dengan meletakkan kertas saring yang telah dibasahi fase gerak sepanjang dinding bagian dalam bejana. 

    Penotolan Zat atau campuran zat yang akan diuji dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Larutan biasanya mengandung 1-20 µg senyawa, ditotolkan dalam bentuk titik 6-10 mm, dengan jarak totolan tidak kurang dari 3 cm.

    Prosedur Kromatografi Kertas Eluasi Menurun

1.     Kertas kromatografi yang telah ditotolkan larutan uji, dimasukkan ke dalam bejana, digantung menggunakan batang untuk memegang ujung atas kertas dalam palung pelarut. [Catatan Pastikan posisi kertas yang menggantung tidak menyentuh rak, dinding bejana kromatografi, ataupun larutan dalam bejana kromatografi].

2.     Bejana kromatografi ditutup rapat, masukkan fase gerak melalu inlet, biarkan sampai bejana kromatografi jenuh dengan uap fase gerak.

3.     Kelebihan tekanan dapat dikurangi bila diperlukan, tutup inlet dan biarkan fase gerak merambat pada kertas secara menurun sesuai dengan jarak yang telah ditentukan.

4.     Keluarkan kertas dari bejana kromatografi.

5.     Tandai batas rambat dan keringkan kertas.

6.     Amati kromatogram secara langsung atau dengan perlakuan lebih lanjut.

    Prosedur Kromatografi Kertas Eluasi Menaik

1.     Masukkan fase gerak ke dalam bejana kromatografi.

2.     Tutup rapat bejana kromatografi hingga jenuh dengan uap fase gerak. Kelebihan tekanan dapat dikurangi bila diperlukan.

3.     Celupkan tepi bawah kertas kromatografi ke dalam fase gerak.

4.     Ketika eluasi sampai pada batas yang telah ditentukan, keluarkan kertas kromatografi, tandai batas rambat dan keringkan.

5.     Amati kromatogram secara langsung atau dengan perlakuan lebih lanjut.

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

    Fase diam Berupa lapisan tipis, kering merata, terbuat dari bahan serbuk halus dilapiskan secara akurat pada suatu lempeng kaca, plastik, atau aluminium. Fase diam dari lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) mempunyai ukuran partikel rata-rata 10-15 µm, dan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT) mempunyai ukuran partikel rata-rata 5 µm. Lempeng siap pakai dengan zona preadsorbent dapat digunakan apabila spesifikasinya sesuai dengan monografi. Sampel ditotolkan pada daerah preadsorbent, dikembangkan dalam pita pendek yang tajam pada batas antara sorbent dan preadsorbent. Pemisahan dicapai berdasarkan adsorpsi, partisi, atau kombinasi dari keduanya, tergantung pada jenis partikel dari fase diamnya.

    Peralatan Bejana kromatografi harus inert, transparan, dengan spesifikasi sebagai berikut: bagian bawah datar atau “twin trough”, berpenutup rapat, dan ukurannya sesuai dengan lempeng. Bagian dalam bejana kromatografi dilapisi kertas saring pada paling tidak satu dindingnya. Fase gerak atau pelarut pengembang dalam jumlah yang sesuai ditambahkan ke dalam bejana kromatografi, setelah impregnasi  kertas saring, gunakan lempeng dengan ukuran yang tepat. Bejana kromatografi ditutup dan dibiarkan jenuh [Catatan Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, pemisahan kromatografi dilakukan pada kondisi bejana  yang jenuh.]

    Deteksi  Untuk pengamatan lakukan dengan lampu UV gelombang pendek (254 nm) dan UV gelombang panjang (365 nm). Berbagai penampak bercak dapat digunakan.

    Penotolan Totolkan larutan pada permukaan lempeng dengan volume penotolan yang telah ditentukan untuk memperoleh totolan dengan diameter 2-5 mm (1-2 mm pada lempeng KLTKT) atau bentuk pita 10-20 mm x 1-2 mm (5-10 mm x 0,5-1 mm pada lempeng KLTKT) dengan jarak yang telah ditetapkan dari tepi bawah dan sisi samping lempeng. [Catatan Selama proses eluasi, posisi penotolan harus sedikitnya 5 mm (KLT) atau 3 mm (KLTKT) di atas permukaan fase gerak].

    Larutan ditotolkan secara paralel dari tepi bawah lempeng dengan jarak antara 2 titik pusat penotolan tidak kurang dari 10 mm untuk KLT (5 mm untuk KLTKT). Untuk penotolan berupa pita, jarak antara 2 ujung pita tidak kurang dari 4 mm untuk KLT (2 mm untuk KLTKT), kemudian biarkan kering.

    Prosedur:

1.     Masukkan lempeng ke dalam bejana kromatografi, pastikan titik atau pita hasil penotolan di atas permukaan fase gerak.

2.     Tutup bejana kromatografi.

3.     Biarkan fase gerak merambat hingga batas yang ditetapkan, tigaperempat tinggi lempeng atau jarak sesuai pada monografi.

4.     Angkat lempeng, tandai batas rambat, keringkan.

5.     Deteksi kromatogram sesuai prosedur.

6.     Tentukan harga Rf  bercak.

7.     Identifikasi sementara dapat dibuat dengan mengamati harga Rf bercak dibandingkan dengan baku. Perbandingan visual dari ukuran atau intensitas bercak atau zona dapat digunakan untuk perkiraan semikuantitatif. Pengukuran kuantitatif dapat dilakukan secara densitometri (pengukuran absorbansi atau fluoresensi).

KROMATOGRAFI KOLOM

    Penyangga padat Gunakan tanah silika yang telah dimurnikan. Pada kromatografi kolom partisi fase balik, gunakan tanah silika yang tersilanisasi untuk kromatografi.

    Fase diam Gunakan pelarut atau larutan yang tertera dalam masing-masing monografi. Jika digunakan campuran cairan sebagai fase diam, campurkan cairan tersebut sebelum diadsorpsikan pada penyangga padat.

    Fase gerak Gunakan Fase gerak yang tertera dalam masing-masing monografi. Jenuhkan dengan air, jika fase diam merupakan larutan dalam air, jika fase diam merupakan cairan organik polar, jenuhkan dengan cairan tersebut.

    Alat Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, tabung kromatografi mempunyai diameter dalam lebih kurang 22 mm dan panjang 200 - 300 mm, tanpa cakram kaca berpori. Pada tabung ini dihubungkan tabung pengalir tanpa keran, dengan diameter dalam lebih kurang 4 mm dan panjang lebih kurang 50 mm.

    Pembuatan Kolom Kromatografi Mampatkan segumpal wol kaca halus pada dasar tabung. Masukkan fase diam dengan volume tertentu, dalam gelas piala berukuran 100 mL sampai 250 mL. Tambahkan sejumlah tertentu penyangga padat dan campur hingga homogen. Masukkan campuran ini ke dalam tabung kromatografi dan mampatkan dengan tekanan sedang, agar diperoleh massa yang homogen. Jika jumlah  penyangga padat ditentukan lebih dari 3 g, masukkan lebih kurang campuran 2 g ke dalam kolom, mampatkan kemudian tambahkan sedikit demi sedikit sambil dimampatkan setiap penambahan sampai habis. Jika untuk penetapan kadar atau pengujian diperlukan kolom bersegmen banyak dengan fase diam yang berlainan untuk masing-masing segmen, lakukan pemampatan tiap segmen, kemudian langsung ditambahkan segmen berikutnya. Mampatkan segumpal wol kaca halus di atas panyangga yang telah lengkap dimampatkan. [Catatan Fase gerak mengalir melalui kolom dengan laju alir sedang atau menetes perlahan-lahan jika menggunakan kromatografi fase balik].

    Jika larutan uji dicampurkan dengan fase diam, masukkan secara kuantitatif ke dalam tabung, dengan membilas gelas piala yang dipakai untuk membuat campuran yang akan diuji dengan suatu campuran yang terdiri dari lebih kurang 1 g penyangga padat dan beberapa tetes pelarut yang dipakai untuk membuat larutan uji, sebelum pemampatan wol kaca.

    Prosedur 

1.     Masukkan fase gerak ke dalam ruang kosong di atas kolom dan biarkan mengalir melalui kolom oleh gaya gravitasi.

2.     Bilas ujung kolom kromatografi dengan lebih kurang 1 mL fase gerak sebelum mengubah komposisi fase gerak dan sesudah selesai eluasi.

3.     Jika zat uji ditambahkan pada kolom sebagai larutan dalam fase gerak, biarkan agar seluruhnya melalui isi kolom, kemudian tambahkan sejumlah kecil fase gerak beberapa kali, tiap kali biarkan pelarut mengalir seluruhnya melewati kolom, sebelum menambahkan sisa fase gerak.

4.     Bila pada penetapan kadar atau pengujian, dikehendaki pemakaian kolom kromatografi bersegmen yang dihubungkan secara seri serta penambahan fase gerak dalam jumlah terbagi, biarkan tiap bagian tersebut seluruhnya melewati kolom, dan bilas ujungnya tiap kali dengan fase gerak, sebelum penambahan sisa pelarut berikutnya

KROMATOGRAFI GAS (KG)

    Fase diam cair  Jenis ini dipakai dalam kolom kemasan dan kolom kapiler.

    Kolom Kemasan KG  Fase diam cair disalutkan pada penyangga padat yang inert dan halus, seperti tanah diatomae, polimer berpori, atau karbon grafit, yang dikemas ke dalam kolom dengan diameter dalam 2-4 mm dan panjang 1-3 m.

    Kolom Kapiler KG  Dalam kolom kapiler tidak terdapat penyangga padat, fase diam cair disalutkan pada permukaan dalam kolom dan dapat berikatan secara kimia dengan permukaan kolom tersebut.

    Fase diam padat  Jenis ini dipakai hanya untuk kolom kemasan. Pada kolom ini fase padat sebagai adsorben aktif, seperti alumina, silika, atau karbon, dikemas ke dalam kolom. Resin poliaromatik berpori yang kadang-kadang digunakan pada kolom kemasan, tidak ditutupi dengan fase cair. [Catatan Kolom kemasan dan kolom kapiler harus dikondisikan sebelum digunakan sampai garis dasar dan parameter lain telah stabil].

    Peralatan Kromatografi gas terdiri dari sumber gas pembawa, injektor, kolom, detektor, dan perangkat perekam. Injektor, kolom dan detektor dikontrol suhunya dan berbeda untuk setiap analisis. Jenis gas pembawa yaitu helium, nitrogen, atau hidrogen, tergantung kolom dan detektor yang digunakan. Jenis detektor yang digunakan tergantung senyawa yang dianalisis dan ditentukan dalam masing-masing monografi. Luaran detektor dibaca sebagai fungsi waktu, sedangkan respons alat diukur sebagai luas puncak atau tinggi puncak dan dibaca sebagai fungsi dari jumlah.

    Program Suhu  Panjang dan mutu dari pemisahan KG dapat dikontrol dengan cara mengubah suhu pada kolom kromatografi. Jika diperlukan, program suhu tercantum pada masing-masing monografi dalam bentuk tabel. Pada tabel dicantumkan suhu awal, rentang perubahan suhu, suhu akhir, dan waktu retensi pada saat suhu akhir.

    Prosedur

1.     Lakukan kesetimbangan kolom, injektor, dan detektor dengan aliran gas pembawa sampai tercapai sinyal yang konstan.

2.     Suntikkan sampel melalui septum injektor atau gunakan autosampler.

3.     Lakukan program suhu.

4.     Rekam kromatogram.

5.     Lakukan analisis seperti tertera pada masing-masing monografi.

KROMATOGRAFI CAIR (KC)

    Istilah kromatografi cair, yang digunakan dalam Farmakope Indonesia adalah kromatografi cair tekanan tinggi atau kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). KC merupakan teknik pemisahan berdasarkan fase diam berupa padatan dan fase gerak berupa cairan.

    Fase diam  Pemisahan dicapai melalui partisi, adsorpsi, atau proses pertukaran ion tergantung jenis fase diam yang digunakan. Fase diam yang paling umum digunakan adalah  silika yang dimodifikasi atau butiran polimerik. Butiran dibuat dengan penambahan hidrokarbon rantai panjang. Jenis fase diam yang diperlukan dalam suatu pengujian dinyatakan dalam masing-masing monografi dan ditunjukkan oleh tanda “L” (lihat juga bagian Kolom Kromatografi, di bawah). Ukuran dari partikel sering disebutkan dalam monografi. Perubahan dalam jenis fase diam dan ukuran diatur dalam bagian Kesesuaian Sistem.

    Kolom Kromatografi Yang dimaksud dengan kolom termasuk baja tahan karat, baja tahan karat berlapis dan kolom polimer dikemas dengan fase diam. Panjang dan diameter dalam kolom mempengaruhi pemisahan, oleh karena itu ukuran kolom dicantumkan dalam masing-masing monografi. Perubahan dalam ukuran kolom dibahas pada bagian Kesesuaian Sistem pada bab ini. Lihat bagian Kolom Kromatografi untuk informasi lebih lanjut.

    Dalam prosedur KC, dapat digunakan suatu guard column dengan persyaratan berikut, jika tidak dinyatakan dalam monografi :

(a)  panjang kolom pelindung tidak melebihi 15% dari panjang kolom analisis,

(b)  diameter dalam harus sama atau lebih kecil dari diameter dalam kolom analisis,

(c)  bahan kemasan harus sama dengan bahan kemasan dari kolom analisis (misalnya silika) dan mengandung bonded phase yang sama (misalnya C18).

(d)  semua persyaratan kesesuaian sistem yang terdapat dalam prosedur resmi harus dipenuhi.

    Fase gerak  Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut seperti tertera dalam masing-masing monografi.

    Peralatan Kromatografi cair terdiri dari wadah berisi fase gerak, pompa untuk mendorong fase gerak masuk ke dalam sistem dengan tekanan tinggi, injektor untuk memasukkan sampel ke dalam fase gerak, kolom kromatografi, detektor, dan perangkat pengumpul data.

    Eluasi Gradien Perubahan komposisi fase gerak selama proses kromatografi disebut eluasi gradien atau program pelarut. Profil eluasi gradien terdapat dalam masing-masing monografi pada tabel yang mengatur waktu dan perubahan komposisi fase gerak.

    Prosedur :

1.     Setimbangkan kolom dan detektor dengan fase gerak dengan laju alir tertentu sampai dicapai kondisi konstan.

2.     Suntikkan sampel melalui injektor, atau gunakan autosampler.

3.     Lakukan program gradien.

4.     Rekam kromatogram

5.     Lakukan analisis kromatogram seperti tertera pada monografi.

DEFINISI DAN INTERPRETASI KROMATOGRAM

    Kromatogram  Kromatogram adalah grafik yang menggambarkan respons detektor, kadar suatu analit dalam eluen, atau jumlah lain yang digunakan untuk menghitung kadar eluat terhadap volume eluen atau waktu. Pada kromatografi planar, kromatogram dapat berupa kertas atau lapisan yang memiliki bercak yang terpisah.

    Gambar 1 Menggambarkan tipe pemisahan kromatografi dari dua senyawa, 1 dan 2. t_R1 dan t_R2 adalah waktu retensi (R_t), dan h adalah tinggi, h/2 adalah setengah tinggi, dan Wh/2 adalah lebar pada setengah tinggi, untuk puncak 1. W₁ dan W₂ adalah lebar puncak 1 dan 2 dihitung dari garis dasar. Puncak udara adalah ciri-ciri kromatogram gas dan berhubungan dengan batas pelarut di dalam kromatografi cair. Waktu retensi dari puncak udara atau komponen yang tidak tertahan, dilambangkan dengan t_M.

Gambar 1. Pemisahan kromatografi dua bahan

    Dwell Volume (D)  Disebut juga gradient delay volume adalah volume antara titik awal fase gerak dan ujung kolom.

    Hold-Up Time (t_M) Adalah waktu yang diperlukan untuk eluasi senyawa yang tidak ditahan di kolom (lihat gambar 1, ditunjukkan sebagai udara atau puncak pelarut yang tidak ditahan, dengan skala garis dasar dalam menit.

    Hold-Up Volume (V_M) Volume fase gerak yang dibutuhkan untuk eluasi komponen yang tidak ditahan. Dapat dihitung dari hold up time dan laju alir F, dalam mL per menit:

    Jumlah Lempeng Teoritis (N) Adalah pengukuran efisiensi kolom. Untuk Puncak Gaussan, dihitung dengan rumus:

t_R adalah waktu retensi (R_t) suatu senyawa, dan W adalah lebar puncak dari dasar, diperoleh dari ekstrapolasi garis lurus disamping puncak ke garis dasar. Nilai N tergantung dari senyawa pada kromatogram sesuai dengan kondisi operasional, seperti laju alir dan suhu dari fase gerak atau gas pembawa, kualitas dari kemasan kolom, dan keseragaman pengemasan kolom, dan pada kolom kapiler, ketebalan dari film fase diam dan diameter internal serta panjang kolom.

    Jika digunakan integrator elektronik untuk menentukan jumlah lempeng teoritis, dapat berdasarkan rumus:

W_h/2  adalah lebar puncak pada setengah tinggi puncak. Jika ada perbedaan hasil perhitungan, hanya rumus dengan lebar puncak dari garis dasar yang digunakan.

    Puncak Puncak adalah bagian dari kromatogram dari respons detektor ketika senyawa tunggal dieluasi dari kolom. Apabila pemisahan tidak lengkap, dua atau lebih komponen bisa jadi tereluasi sebagai puncak yang tidak terpisah.

    Perbandingan Puncak terhadap lembah (p/v)  Nilai p/v digunakan sebagai kriteria kesesuaian sistem dalam pengujian untuk zat terkait jika garis dasar untuk pemisahan dua puncak tidak tercapai. Gambar 2 merupakan pemisahan sebagian dari dua zat, dimana H_p adalah tinggi dihitung dari tinggi puncak terkecil diatas garis dasar dan H_v adalah tinggi dihitung dari titik terendah antara dua puncak yang terpisah dari garis dasar.

Gambar 2.  Penetapan perbandingan

puncak terhadap lembah

    Hambatan relatif (R_ret) adalah perbandingan jarak yang ditempuh oleh analit terhadap jarak yang ditempuh oleh senyawa pembanding (lihat Gambar 3) dan digunakan dalam kromatografi planar.

Gambar 3. Tipe kromatografi planar

    Retensi relatif (r) Adalah perbandingan dari waktu retensi suatu komponen relatif terhadap komponen lainnya yang digunakan sebagai pembanding yang sesuai pada kondisi yang sama.

t_R2 adalah waktu retensi diukur dari titik injeksi suatu senyawa target, t_R1 adalah waktu retensi diukur dari titik injeksi senyawa yang digunakan sebagai pembanding, dan t_M adalah hold-up time pada kondisi percobaaan yang sama pada kolom yang sama.

    Waktu Retensi Relatif Atau dikenal sebagai retensi relatif yang tidak diatur. Kecuali jika dinyatakan lain, di dalam FI biasanya dikenal dengan istilah retensi relatif yang tidak diatur.

    Simpangan Baku Relatif  (SBR) dalam persentase

    Resolusi (R) Adalah pemisahan antara dua komponen dalam suatu campuran, dihitung dengan :

t_R2 dan t_R1 adalah waktu retensi dari komponen 2 dan 1, dan W₂ dan W₁ adalah lebar masing-masing puncak dari dasar, diperoleh dari ekstrapolasi garis lurus disamping puncak ke garis dasar.

    Jika digunakan integrator elektronik untuk menentukan resolusi dapat dihitung dengan :

    Faktor hambatan (R_F) Adalah perbandingan dari jarak yang ditempuh dari pusat bercak terhadap jarak keseluruhan yang ditempuh oleh fase gerak dan digunakan dalam kromatografi planar. Dengan menggunakan simbol dalam Gambar 3 :

    Faktor retensi (k) : juga dikenal dengan sebutan faktor kapasitas (k’). Didefinisakan sebagai:

Atau

Faktor retensi suatu komponen dapat ditentukan dari kromatogram :

    Waktu retensi (R_t) Pada kromatografi cair dan kromatografi gas, waktu retensi, R_t, didefinisikan sebagai waktu yang ditempuh antara proses injeksi sampel dan munculnya puncak maksimum sebagai respons dari zona sampel yang tereluasi. R_t dapat digunakan sebagai suatu parameter untuk identifikasi. Kromatogram waktu retensi merupakan karakterisitk suatu senyawa tapi tidak khas. Adanya waktu retensi suatu sampel dan baku pembanding dapat digunakan sebagai salah satu kriteria dalam pembuatan suatu profil identifikasi tapi tidak cukup untuk menentukan identitas. Waktu retensi absolut yang diberikan oleh satu senyawa dapat berbeda dari kromatogram satu dengan lainnya.

    Volume Retensi (V_R) Adalah volume fase gerak yang dibutuhkan untuk mengeluasi suatu komponen. Dapat dihitung dari waktu retensi dan laju alir dalam mL per menit :

    Faktor pemisahan (?) Adalah retensi relatif yang dihitung untuk dua puncak yang berdekatan (ketentuan, nilai faktor pemisahan selalu >1) :

    Faktor simetri (A_s) Faktor simetri dikenal juga dengan sebutan faktor ikutan suatu puncak (lihat gambar 4) dihitung dengan :

W_0,05 adalah lebar puncak pada 5% tinggi dan f adalah jarak dari puncak maksimum terhadap tepi puncak,  jarak diukur dari titik 5% tinggi puncak dari garis dasar.

Gambar 4. Puncak kromatografi asimetri

Faktor asimetri dapat dihitung dengan rumus :

Dalam FI, gunakan perhitungan faktor simetri.

    Faktor ikutan (T) lihat faktor simetri.

KESESUAIAN SISTEM

    Uji kesesuaian sistem adalah bagian integral dari metode kromatografi cair dan kromatografi gas. Uji ini digunakan untuk verifikasi bahwa sistem kromatografi memadai untuk analisis tersebut. Uji kesesuaian sistem ini didasarkan pada konsep bahwa peralatan, elektronik, operasi analitis dan sampel yang diuji, merupakan bagian dari sistem integral yang dapat dievaluasi.

Faktor yang dapat mempengaruhi kondisi kromatografi adalah seperti berikut ini :

·       Komposisi, kekuatan ion, suhu, dan pH fase gerak

·       Laju alir, ukuran kolom, suhu kolom, dan tekanan

·       Karakteristik fase diam, termasuk tipe bahan pendukung kromatografi (berbasis partikel atau monolitik), partikel atau ukuran pori besar, porositas dan area permukaan spesifik.

·       Fase balik dan modifikasi permukaan lain fase diam, tingkat modifikasi kimia (seperti end-capping, carbon loading, dll.)

    Resolusi, R, adalah fungsi dari jumlah lempeng teoritis, N (disebut juga sebagai efisiensi), faktor pemisahan, ?, dan faktor kapasitas, k’. [Catatan Semua istilah dan simbol didefinisikan pada bagian sebelumnya Definisi dan Interpretasi Kromatogram.] Untuk fase gerak dan fase diam tertentu, N dapat ditentukan untuk memastikan bahwa pemisahan saksama senyawa satu dan lainnya, untuk menetapkan kekuatan pemisahan secara umum dalam suatu sistem, dan untuk memastikan bahwa baku internal terpisah dari senyawa obat. Ini adalah cara yang kurang dapat diandalkan untuk memastikan resolusi/pemisahan daripada pengukuran langsung. Efisiensi kolom adalah bagian dari refleksi ketajaman suatu puncak, sangat penting untuk mendeteksi komponen renik.

    Penyuntikan ulang larutan baku atau larutan lainnya perlu dilakukan untuk memastikan apakah persyaratan presisi terpenuhi. Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, data dari 5 kali penyuntikan ulang suatu analit digunakan untuk menghitung Simpangan Baku Relatif (SBR), jika persyaratannya adalah 2,0% atau kurang; dan data dari 6 kali penyuntikan ulang digunakan jika persyaratan SBR lebih dari 2,0%.

     Untuk Penetapan Kadar dalam monografi bahan obat, dengan kadar 100%, dan tidak ada simpangan baku relatif maksimum yang ditetapkan, %SBR dihitung dari penyuntikan ulang larutan baku dengan rumus:

K adalah konstanta (0,349), didapat dari persamaan:

0,6/?2  representasi persentase SBR setelah 6 kali penyuntikan untuk B=1,0%; B adalah persentase batas atas yang dinyatakan dalam definisi masing-masing monografi dikurangi 100%, n adalah jumlah penyuntikan ulang (3?n?6); dan t_90%,n-1 adalah Students t pada probabilitas 90% (dua sisi) dengan derajat kebebasan n-1.

    Kecuali dinyatakan lain, simpangan baku relatif maksimum tidak boleh melampaui nilai yang ditetapkan seperti tertera pada tabel persyaratan simpangan baku relatif (SBR). Persyaratan ini tidak diterapkan pada uji senyawa sejenis.

Persyaratan Simpangan baku Relatif  (SBR)

    Faktor simetri, A_s, ukuran simetri suatu puncak, adalah satuan untuk puncak yang simetris sempurna, dan nilainya meningkat ketika tailing menjadi lebih jelas (lihat Gambar 4). Pada beberapa kasus, nilai yang kurang dari 1 dapat diamati. Ketika simetri suatu puncak menjauh dari angka 1, integrasi, dan oleh karena itu presisi menjadi kurang dapat dipercaya.

    Perbandingan signal to noise (S/N) berguna untuk parameter kesesuaian sistem. S/N dapat dihitung sebagai berikut :

H adalah tinggi puncak yang diukur dari pucak ke garis dasar yang diekstrapolasikan dengan jarak ? 5 kali lebar setengah tinggi puncak dan h adalah perbedaan antara noise tertinggi dengan noise terendah yang diamati pada jarak ? 5 kali lebar pada setengah tinggi puncak dan, apabila memungkinkan, noise tersebut terletak simetris disekitar puncak yang diinginkan (lihat Gambar 5).

Gambar 5.  Noise dan puncak kromatogram,  

Komponen dari rasio S/N

    Uji Kesesuaian Sistem ini dilakukan dengan cara mengumpulkan data dari penyuntikan ulang larutan baku atau larutan lainnya yang telah ditetapkan dalam masing-masing monografi.

    Spesifikasi parameter di dalam monografi tidak membatasi penggunaan dari kondisi operasional yang sesuai lainnya.

    Penyesuaian pada sistem kromatografi yang telah ditentukan diperlukan untuk pemenuhan persyaratan kesesuaian sistem. Penyesuaian pada sistem kromatografi yang dilakukan untuk memenuhi persyaratan kesesuaian sistem, tidak dilakukan jika terjadi kegagalan kolom atau sistem tidak berfungsi. Penyesuaian dibolehkan hanya jika:

·       Baku yang sesuai (termasuk baku pembanding) tersedia untuk semua senyawa yang digunakan dalam uji kesesuaian sistem; dan

·       Penyesuaian atau penggantian kolom dapat menghasilkan kromatogram yang memenuhi semua  persyaratan kesesuaian sistem yang telah ditetapkan pada prosedur resmi

    Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, hal tersebut dibawah adalah variasi maksimum yang dapat dipertimbangkan. Perubahan ini dapat membutuhkan data verifikasi tambahan.  Untuk melakukan verifikasi terhadap kesesuaian metode dengan kondisi baru, lakukan penilaian terhadap karateristik kinerja analitik relevan yang berpotensi dipengaruhi oleh perubahan. Banyaknya perubahan dapat mempengaruhi secara kumulatif kinerja sistem dan harus dipertimbangkan secara hati-hati sebelum diterapkan. Perubahan ini seperti, menggunakan kolom KCKT yang berbeda dimensi seperti yang ditentukan dalam prosedur resmi (berbeda panjang, diameter dalam, dan/atau ukuran partikel). Dalam hal lain, perubahan karakteristik kimia (jenis “L”) dari fase diam akan dianggap sebagai modifikasi pada metode dan akan memerlukan validasi penuh. Pengaturan terhadap komposisi fase gerak dalam eluasi gradien yang dapat menyebabkan perubahan selektivitas, tidak direkomendasikan. Jika penyesuaian diperlukan, perubahan yang diperbolehkan hanya kolom (mempertahankan karakteristik kimia sama), lama waktu awal tahap isokratis (yang ditetapkan pada monografi) dan/atau penyesuaian dwell volume. Penyesuaian gradien tambahan yang diperbolehkan dijelaskan dibawah ini.

    pH Fase Gerak (KCKT)  pH suatu larutan dapar yang digunakan dalam pembuatan fase gerak dapat disesuaikan ± 0,2 satuan nilai atau rentang yang ditentukan. Berlaku untuk pemisahan gradien dan isokratik.

    Kadar garam dalam dapar (KCKT) Kadar garam yang digunakan dalam pembuatan larutan dapar untuk fase gerak dapat disesuaikan ±10% apabila variasi pH yang diperbolehkan tercapai. Berlaku untuk pemisahan gradien dan isokratik.

    Perbandingan komponen dalam fase gerak (KCKT) Batas penyesuaian berikut berlaku untuk komponen kecil fase gerak (50% atau kurang). Jumlah komponen ini dapat disesuaikan ± 30% relatif tetapi tidak dapat melebihi ±10% absolut dari jumlah fase gerak. Penyesuaian dilakukan pada satu komponen minor dalam campuran terner. Contoh penyesuaian untuk campuran biner dan terner seperti dibawah ini.

    Campuran Biner

    Perbandingan  50:50. 30% dari 50 adalah 15% absolut, melebihi perubahan maksimal yang dibolehkan yaitu ±10% absolut. Oleh karena itu, perbandingan fase gerak dapat disesuiakan hanya pada rentang 40:60 - 60:40.

    Perbandingan 2:98. 30% dari 2 adalah 0,6% absolut. Penyesuaian maksimal yang dibolehkan adalah pada rentang 1,4 : 98,6 - 2,6 : 97,4.

    Campuran Terner

    Perbandingan 60:35:5. Untuk komponen kedua, 30% dari 35 adalah 10,5% absolut, oleh karena itu penyesuaian maksimal yang dibolehkan ±10% absolut dari tiap komponen. Oleh karena itu komponen kedua dapat disesuaikan dalam rentang 25% - 45% absolut. Untuk komponen ketiga, 30% dari 5 adalah 1,5% absolut. Pada semua kasus, jumlah komponen utama disesuaikan untuk menghasilkan total 100%. Oleh karena itu rentang campuran adalah 50:45:5 - 70:25:5 atau 58,5: 35:6,5 - 61,5:35:3,5 akan memenuhi persyaratan.  

    Panjang gelombang pada detektor UV-Vis (KCKT) Penyimpangan panjang gelombang yang ditentukan dalam prosedur tidak dibolehkan. Prosedur ditentukan oleh pabrik pembuat detektor, atau prosedur validasi lainnya yang digunakan untuk memverifikasi kesalahan panjang gelombang detektor adalah paling banyak ±3 nm.

    Fase diam

    Panjang kolom (KG) Dapat disesuaikan ±70%.

    Panjang kolom (KCKT) Lihat Ukuran Partikel di bawah.

    Diameter internal kolom (KCKT) Dapat disesuaikan jika kecepatan linear dijaga konstan. Lihat Laju Alir (KCKT) dibawah.

    Diameter internal kolom (KG) Dapat disesuaikan ± 50%

    Ketebalan film (kolom kapiler KG) Dapat disesuaikan minimal 50% dan tidak lebih dari 100%.

    Ukuran partikel (KCKT) Untuk pemisahan isokratik, ukuran partikel dan/atau panjang kolom dapat dimodifikasi jika perbandingan panjang kolom (L) dengan ukuran partikel (dp) tetap konstan atau dalam rentang minimal 25% dan tidak lebih dari 50% dari perbandingan L/dp yang ditentukan. Alternatif untuk penerapan penyesuaian ukuran partikel berpori, kombinasi lain L dan dp dapat digunakan  jika jumlah lempeng teoritis (N) dalam rentang minimal 25% dan tidak lebih dari 50%, relatif terhadap kolom yang ditentukan. Harus diperhatikan jika penyesuaian menunjukkan jumlah lempeng teoritis lebih besar dari volume puncak yang lebih kecil, dengan meminimalkan perluasan pita ekstra-kolom oleh faktor pipa instrumen, detektor volume sel kecepatan dan volume penyuntikan. Jika ukuran partikel tidak disebutkan dalam monografi, perbandingan harus dihitung menggunakan ukuran partikel terbesar yang ada dalam definisi kolom. Untuk pemisahan gradien, perubahan panjang, diameter dalam kolom, dan ukuran partikel tidak diperbolehkan.

    Ukuran partikel (KG) Perubahan ukuran partikel pendukung KG dari besar ke lebih kecil atau dari yang lebih kecil ke yang lebih besar dapat diterima jika kromatografi memenuhi persyaratan kesesuaian sistem dan kisaran ukuran partikel yang sama dipertahankan. Rasio perubahan ukuran partikel didefinisikan sebagai diameter partikel terbesar dibagi dengan diameter partikel terkecil.

    Laju alir (KG) Laju alir dapat disesuaikan ±50%.

    Laju alir (KCKT) Jika ukuran partikel diubah, laju alir memerlukan penyesuaian, karena kolom dengan partikel kecil membutuhkan kecepatan linear yang lebih tinggi untuk  kinerja yang sama  (yang ditunjukkan dengan pengurangan jumlah lempeng). Perubahan laju alir baik untuk perubahan diameter kolom dan ukuran partikel dapat dihitung dengan rumus:

F₁ dan F₂ masing masing adalah laju alir; dc₁ dan dc₂ masing masing adalah diameter kolom; dan dp₁ dan dp₂ adalah ukuran partikel pada kondisi awal dan setelah modifikasi.

    Jika perubahan partikel dari ?3-?m menjadi ?3-?m dalam pemisahan isokratik, tambahan peningkatan kecepatan linier (dengan menyesuaikan laju alir) diperbolehkan, jika efisiensi kolom tidak turun lebih dari 20%. Hal yang sama, jika perubahan partikel dari ?3-?m menjadi ?3-?m perlu pengurangan kecepetan linier (laju alir) untuk menghindari pengurangan efisiensi kolom lebih dari 20%. Untuk pemisahan gradien, perubahan dalam F, dc, dan dp tidak diperbolehkan.

    Untuk isokratik, laju alir dapat disesuaikan ±50%. Contoh : Kombinasi penyesuaian panjang kolom, diameter internal, ukuran partikel dan laju alir dapat digunakan untuk memperoleh kondisi yang setara (N yang sama), tetapi berbeda dalam tekanan dan waktu kromatografi. Tabel dibawah ini mencantumkan beberapa konfigurasi kolom yang umum untuk memberikan efisiensi (N) yang setara dengan menyesuaikan variabel ini.

Contoh, jika di dalam monografi disebutkan panjang kolom dengan ukuran 4,6-mm x 150-mm; ukuran partikel 5-?m dengan laju alir 1,5 mL per menit, diharapkan terjadi pemisahan yang sama dengan menggunakan kolom  ukuran 2,1-mm x 75-mm; ukuran partikel 2,5 ?m dengan laju alir 1,5 mL per menit x 0,4 = 0,6 mL menit, dengan peningkatan tekanan sekitar 4 kali dan pengurangan waktu kromatografi lebih kurang 30% dari yang tercantum dalam monografi.

   Volume penyuntikan (KCKT) Volume penyuntikan  dapat disesuaikan sejauh konsisten dengan  keberterimaan presisi, linearitas  dan batas deteksi. [Catatan, volume penyuntikan yang berlebihan dapat menyebabkan pelebaran pita yang tidak dapat diterima, karena menyebabkan penurunan N dan resolusi. Hal ini berlaku untuk pemisahan gradien dan isokratik.]

    Volume penyuntikan dan Volume Split (KG)  Volume penyuntikan dan volume split dapat disesuaikan apabila deteksi dan keberulangan dapat diterima.

    Suhu kolom (KCKT) Suhu kolom dapat diatur ±10º. Termostat untuk kolom direkomendasikan untuk meningkatkan kontrol dan keberulangan waktu retensi. Hal ini berlaku untuk pemisahan gradien dan isokratik.

    Suhu oven (KG) Suhu oven dapat diatur ± 10%.

    Program suhu oven (KG)  Program suhu oven (KG)  Pengaturan suhu dapat disesuaikan. Jika suhu yang telah ditetapkan harus dipertahankan atau jika suhu harus diubah dari nilai satu ke nilai lainnya, diperbolehkan pengaturan ±20%.

    Kecuali jika dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, parameter kesesuaian sistem ditentukan dari puncak analit.

    Nilai yang diukur, R_r, R_f, atau R_t suatu zat tidak menyimpang dengan nilai yang diperoleh dari baku pembanding dan campuran zat-baku pembanding.  Waktu retensi relatif yang tercantum dalam monografi hanya untuk tujuan informasi dalam membantu identifikasi puncak. Tidak ada kriteria keberterimaan yang dipakai dalam waktu retensi relatif.

    Uji kesesuaian sistem digunakan untuk memastikan keefektifan sistem operasional yang harus dilakukan. Lakukan penyuntikan atau preparasi larutan yang memadai sesuai kebutuhan untuk menunjukkan kesesuaian sistem yang sesuai (seperti yang ditetapkan pada  Sistem kromatografi dalam monografi).

    Preparasi dapat berupa larutan baku atau larutan yang mengandung sejumlah analit yang diketahui dan beberapa penambahan bahan (misalnya eksipien atau cemaran) yang digunakan dalam mengatur sistem analisis. Jika terjadi perubahan signifikan dalam sistem kromatografi (peralatan, komponen fase gerak, atau komponen  lainnya) atau pereaksi kritikal, Uji Kesesuaian sistem harus dilakukan kembali. Tidak ada hasil pengujian yang dapat diterima kecuali telah dilakukan uji kesesuaian sistem.

KUANTITASI

    Selama kuantitasi, abaikan puncak yang disebabkan oleh pelarut dan pereaksi atau yang muncul karena adanya fase gerak ataupun matriks sampel.

    Dalam rentang linier, luas puncak dan tinggi puncak biasanya sebanding dengan kuantitasi elusi suatu senyawa. Luas puncak dan tinggi puncak biasanya diukur dengan cara integrator elektronik tapi dapat juga ditentukan dengan cara pendekatan manual. Luas puncak umumnya digunakan tapi kurang akurat jika terdapat puncak pengganggu. Komponen yang diukur dipisahkan dari beberapa komponen pengganggu. Puncak dengan ikutan dan “fronting” diminimalisasi dan pengukuran puncak pada ikutan puncak lainnya sebaiknya dihindari.

    Walaupun perbandingan suatu puncak cemaran  dengan puncak baku cemaran pada kromatogram dengan kadar yang sama lebih disukai, uji cemaran dapat didasarkan pada pengukuran respons puncak cemaran dan dinyatakan sebagai persentase area dari seluruh puncak dapat berupa obat itu sendiri pada kadar yang setara dengan misalnya 0,5% cemaran  dengan asumsi memberikan respons puncak serupa. Jika cemaran  harus ditetapkan, gunakan baku cemaran itu sendiri atau lakukan faktor koreksi berdasarkan respons relatif cemaran terhadap komponen utama.

    Metode baku eksternal Kadar suatu komponen didapat dengan cara membandingkan respons yang dihasilkan oleh larutan uji dengan respons dihasilkan oleh larutan baku.

    Metode baku internal Jumlah yang sama dari baku internal dimasukkan  ke dalam larutan  uji dan larutan baku. Baku internal yang dipilih tidak bereaksi dengan bahan yang diuji, stabil, terpisah dari komponen yang diukur (analit), dan tidak mengandung cemaran  dengan waktu retensi yang sama  seperti analit. Kadar analit didapat dengan cara membandingkan luas puncak atau tinggi puncak analit dan baku internal dalam larutan uji dengan perbandingan luas puncak atau tinggi puncak dan baku internal dalam larutan baku.

    Prosedur normalisasi Persentase kandungan suatu komponen dihitung dengan cara menentukan luas puncak yang dimaksud sebagai persentase terhadap total luas semua puncak yang ada, tidak termasuk luas puncak yang disebabkan pelarut atau pereaksi atau yang timbul dari fase gerak atau matriks dan/atau puncak dibawah batas yang dapat diabaikan.

    Prosedur kalibrasi  Hubungan antara sinyal (y) yang diukur dan kuantitas (misalnya kadar, bobot) dari bahan x dapat ditentukan dan fungsi kalibrasi dapat dihitung. Hasil analisis dihitung dari sinyal analit yang diukur dan posisinya pada kurva kalibrasi.

    Pada uji cemaran untuk Metode Baku Eksternal, jika pengenceran larutan uji digunakan untuk pembanding, dan Prosedur Normalisasi, diterapkan faktor koreksi yang tercantum dalam monografi (contoh ketika faktor respons relatif berada diluar rentang 0,8 – 1,2).

    Jika pada uji cemaran ditetapkan total cemaran atau ada penetapan kuantitatif cemaran, penting untuk memilih pengaturan ambang batas dan kondisi yang tepat untuk integrasi puncak area. Umumnya batas puncak yang dapat diabaikan adalah ?0,05%. Selanjutnya ambang batas dari sistem pengumpulan data sesuai dengan sekurang kurangnya setengah dari batas (0,05%). Integrasi luas puncak pada beberapa cemaran yang tidak sepenuhnya terpisah dari puncak utama, sebaiknya berdasarkan ekstrapolasi lembah terhadap lembah (tangential skim).     

KOLOM KROMATOGRAFI                 

    Daftar isi kolom (L), fase (G) dan penyangga (S) berikut ini merupakan acuan bagi pemakai kromatograf. [Catatan Ukuran partikel dalam daftar ini merupakan ukuran yang umum digunakan. Apabila diperlukan ukuran partikel yang lain, umumnya yang lebih halus, maka ukuran tersebut dinyatakan pada masing-masing monografi. Untuk suatu kategori isi kolom atau fase yang tercantum dalam daftar dibawah ini, tersedia berbagai kolom. Apabila kondisi kromatografi perlu dinyatakan secara lebih spesifik maka hal itu dinyatakan pada masing-masing monografi.]

Isi Kolom

    L1 Oktadesil silana terikat secara kimiawi pada partikel mikro silika berpori atau partikel mikro keramik, dengan diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L2 Oktadesil silana terikat secara kimiawi pada silika gel dengan porositas permukaan yang diatur dan terikat pada suatu inti bulat padat diameter 30 mm sampai 50 mm.

    L3 Partikel silika berpori, diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L4 Silika gel dengan porositas permukaan yang diatur dan terikat pada suatu inti bulat padat, diameter 30 mm sampai 50 mm.

    L5 Alumina dengan porositas permukaan yang diatur, dan terikat pada suatu inti bulat padat, diameter 30 mm sampai 50 mm.

    L6 Penukar kation kuat berupa polimer fluoro karbon tersulfonasi dilapiskan pada suatu inti bulat padat, diameter 30 mm sampai 50 mm.

    L7 Oktilsilana terikat secara kimiawi pada partikel silika yang berpori seluruhnya atau berpori permukaan, diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L8 Suatu lapisan monomolekuler aminopropil silana yang terikat secara kimiawi pada penyangga silika gel yang berpori seluruhnya, diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L9 Silika gel tak beraturan, ukuran 3 mm sampai 10 mm, yang seluruhnya berpori dan diberi lapisan penukar kation yang bersifat asam kuat dan terikat secara kimiawi.

    L10 Gugus nitril yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori, diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L11 Gugus fenil yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori, diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L12 Suatu penukar anion kuat untuk isi kolom yang dibuat dari amina kuartener yang terikat secara kimiawi pada inti silika bulat padat, diameter 30 mm sampai 50 mm.

    L13 Trimetilsilana yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori, diameter 3 mm sampai 10 mm.

    L14 Silika gel, diameter 5 mm sampai 10 mm, dengan lapisan penukar anion ammonium kuartener yang bersifat basa kuat dan terikat secara kimiawi.

    L15 Heksilsilana yang terikat secara kimiawi pada partikel silika yang berpori seluruhnya, diameter 3 mm sampai 10 mm.

    L16 Dimetilsilana yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori, diameter 5 mm sampai 10 mm.

    L17 Resin penukar kation kuat yang terdiri dari kopolimer ikatan silang stirena-divinilbenzena tersulfonasi dalam bentuk hidrogen, diameter 6 mm sampai 12 mm.

    L18 Gugus amino dan siano yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori, diameter 3mm sampai 10 mm.

    L19 Resin penukar kation kuat yang terdiri dari kopolimer ikatan silang stirena-divinilbenzena tersulfonasi dalam bentuk kalsium, diameter 5 mm sampai 15 mm.

    L20­ Gugus dihidroksipropan yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori atau partikel hibrid, diameter 1,5 mm sampai 10 mm, atau batang silika monolitik.

    L21 Suatu kopolimer stirena-divinilbenzena ber bentuk bulat yang kaku, diameter 3 mm sampai 30 mm.

    L22 Resin penukar kation terbuat dari gel poli stiren yang berpori dengan gugus asam sulfonat, diameter 5 mm sampai 15 mm.

    L23 Resin penukar anion terbuat dari gel polimeta krilat atau poliakrilat berpori dengan gugus amonium kuartener, ukuran 7 mm sampai 12 mm. 

    L24 Polivinilalkohol yang terikat secara kimiawi pada partikel silika berpori, diameter 5 mm.

    L25 Isi kolom dengan kemampuan untuk memisahkan senyawa-senyawa dengan bobot molekul 100 hingga 5000 (ditentukan sebagai polietilen oksida), yang dipakai untuk polimer larut air yang bersifat netral, anionik dan kationik. Yang sesuai untuk digunakan adalah resin polimetakrilat yang mempunyai ikatan silang dengan eter polihidroksil (permukaannya mengandung sedikit sisa gugus fungsi karboksil).   

    L26  Butil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel silika yang berpori seluruhnya atau berpori permukaan, diameter 1,5 mm sampai 10mm.   

    L27 Partikel silika berpori, diameter 30 mm sampai 50 mm.

    L28 Suatu penyangga multifungsi, yang terdiri dari substrat silika berbentuk bulat, dengan tingkat kemurnian tinggi, ukuran 100 Angstrom, yang terikat dengan gugus fungsi anion (amina) disamping fungsi fase balik C8 konvensional. 

    L29 Partikel polibutadiena-alumina berbentuk bulat (gamma alumina, fase balik, persen bobot karbon rendah), diameter 5 mm dengan volume pori 80 Angstrom.

    L30 Etil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel silika yang berpori seluruhnya, diameter 3 mm sampai 10mm.

    L31 Resin penukar anion kuat, amina kuarterner, selektif terhadap hidroksida, terikat pada partikel lateks pada inti partikel makro pori dengan diameter inti 8,5 mm dengan ukuran pori 2000 angstrom dan mengandung ikatan silang etil-vinil benzena dengan divinilbenzena 55%.

    L32 Suatu penukar ligan kiral disalut dalam kompleks tembaga L-prolina yang terikat secara kovalen pada partikel silika tidak beraturan, diameter 5 mm sampai 10 mm.   

    L33 Kolom berisi silika berbentuk bulat dan diproses untuk memberikan stabilitas pH dengan kapasitas pemisahan molekul dekstran berukuran 4.000 sampai 500.000 Da.

    L34 Resin penukar kation kuat yang terdiri dari ikatan silang kopolimer stirena-divinilbenzena tersulfonasi dalam bentuk garam Pb, diameter 7 mm sampai 9 mm.

    L35 Silika berbentuk bulat yang distabilisasi dengan zirkonium dan disalut dengan satu fase lapisan molekul hidrofilik (tipe diol) berpori dengan ukuran 150Å.

    L36 Turunan 3,5 dinitrobenzoil dari L-fenilglisin yang terikat secara kovalen pada aminopropil silika yang berukuran 5mm.

    L37 Gel polimetakrilat dengan kapasitas pemisahan molekul protein berukuran 2.000 sampai 40.000 Da.

    L38 Kolom eksklusi ukuran berisi metakrilat untuk zat uji yang larut dalam air.

    L39 Gel polihidroksimetakrilat hidrofilik dari resin bulat yang berpori seluruhnya.

    L40 Partikel silika berpori dengan diameter 3 mm sampai 20 mm yang dilapisi selulosa tris 3-5-dimetilfenilkarbamat.

    L41 ?₁ Asam glikoprotein yang tidak bergerak pada partikel silika bulat dengan diameter 5 mm.

    L42 Gugus oktilsilana dan oktadesilsilana yang terikat secara kimia pada partikel silika berpori, diameter 5mm.

    L43 Gugus pentafluorofenil yang terikat secara kimia pada partikel silika oleh  propil“spacer”, diameter 1,5mm sampai 10mm.

    L44 Penyangga multifungsional yang berisi substrat silika bulat dengan kemurnian tinggi 60 Å, yang terikat dengan penukar kation, asam sulfonat, dalam fase balik konvensional C8.

   L45 Beta siklodekstrin, turunan R,S-hidroksipropil eter yang terikat pada partikel silika berpori, diameter 3mm sampai 10mm.

    L46 Substrat polistirena/ divinilbenzena yang teraglomerasi pada butiran lateks amonium kuarterner, diameter lebih kurang 9 mm sampai 11mm.

    L47 Substrat mikropori penukar anion berkapasitas tinggi yang dibuat berfungsi dengan gugus trimetilamina diameter 8mm.

    L48 Polistirena dengan ikatan silang tersulfonasi dengan butiran mikro penukar anion berpori, dengan lapisan luar submikron, diameter 5mm  sampai 15mm.

    L49 Kolom fase balik yang berisi partikel zirkonia bulat berpori dengan lapisan tipis polibutadiena dengan diameter 3 mm sampai 10 mm.

    L50 Resin multifungsional dengan penahan fase balik yang berfungsi sebagai penukar anion kuat, berisi 55% ikatan silang etilvinilbenzena dengan polimer divinilbenzena, diameter 3 mm sampai 15 mm, dan luas permukaan tidak kurang dari 350 m² per gram. Substrat disalut dengan partikel lateks yang difungsikan dengan ammonium kuarterner berisi ikatan silang stirena-divinilbenzena. 

    L51 Partikel silika bulat berpori, disalut dengan amilosa tris 3,5-dimetilfenilkarbamat, diameter 3mm sampai 10mm.

    L52 Resin penukar kation kuat yang terbuat dari silika berpori dengan gugus sulfopropil, diameter 5mm sampai 10mm.

    L53 Resin penukar kation lemah terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena 55% dengan kopolimer divinil benzena, diameter 3mm sampai 15 mm. Substrat merupakan permukaan dengan tambahan monomer difungsikan dengan asam karboksilat dan/atau asam fosfat. Kapasitas tidak kurang dari 500 mEq per kolom.

    L54 Kolom eksklusi ukuran sedang yang terbuat dari ikatan kovalen dekstran dengan ikatan silang kuat butiran agarosa berpori, diameter 5mm sampai 15 mm.

    L55 Resin penukar kation kuat yang terbuat dari silika berpori yang dilapisi dengan kopolimer asam maleat-polibutadiena, diameter lebih kurang 5 mm.

    L56 Propilsilana yang terikat secara kimia pada partikel silika yang berpori seluruhnya atau berpori permukaan, diameter 3 mm sampai 10 mm.

    L57 Ovomukoid yang diketahui sebagai protein kiral yang terikat secara kimia pada partikel silika, diameter lebih kurang 5 mm dan ukuran pori 120Å.

    L58 Resin penukar kation kuat yang terdiri dari ikatan silang kopolimer stirena-divinilbenzena tersulfonasi dalam bentuk garam natrium, diameter lebih kurang  6 mm sampai 30 mm.

    L59 Kolom ekslusi ukuran berisi silika (1,5mm sampai 10mm) atau kolom yang disalut dengan lapisan hidrofilik dan mempunyai kapasitas pemisahan protein dengan berat molekul 5 kDa  sampai  7000 kDa.

    L60 Silika gel bulat berpori dengan diameter   10mm atau kurang, yang permukaannya dimodifikasi dengan ikatan kovalen gugus alkil amida dan endcapped.

    L61 Resin penukar anion kuat selektif terhadap hidroksida terdiri dari ikatan silang kuat pada inti  partikel mikropori, ukuran 13 mm, pori berukuran tidak kurang dari 10Å unit dan terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena dengan lapisan lateks yang tersusun dari butiran mikro berukuran 85 nm, terikat dengan ion alkanol ammonium kuarterner 6%.

    L62 Fase silana C30 terikat pada silika bulat yang berpori seluruhnya,  diameter 3mm sampai 15mm.

    L63 Glikopeptida teikoplanin terhubung melalui ikatan kovalen ganda pada partikel silika bulat dengan diameter 100 Å unit.

    L64 Resin penukar anion basa kuat yang terbuat dari 8% ikatan silang kopolimer stirena-divinilbenzena dengan gugus amonium kuartener dalam bentuk klorida, dengan diameter 45 sampai 180 µm.

    L65 Resin penukar kation asam kuat yang terbuat dari 2% ikatan silang kopolimer stirena-divinilbenzena tersulfonasi dengan gugus asam sulfonat dalam bentuk hidrogen dengan diameter 45µm sampai 250 µm.

    L66 Eter mahkota berlapis subtrat gel silika dengan ukuran partikel 5 µm. Sisi aktif adalah (S)-18-mahkota-6-eter.

    L67 Kopolimer vinil alkohol berpori dengan gugus alkil C18 terikat dengan gugus hidroksil polimer, dengan diameter 2 µm sampai 10 µm.

    L68 Silika bulat berpori, dengan diameter 10 µm atau kurang,  permukaan secara kovalen dimodifikasi dengan gugus alkil amida dan tidak endcapped.

    L69 Substrat etilvinilbenzena/divinilbenzena yang teraglomerasi dengan partikel lateks ukuran 130nm yang difungsikan pada ammonium kuarterner, dengan diameter lebih kurang 6,5 mm.

    L70 Silika dengan diameter 5 µm berlapis selulosa tris(fenil karbamat).

    L71 Polimetakrilat bulat dan kaku dengan diameter 4 µm sampai 6 µm.

    L72 (S)-fenilglisin dan urea 3,5-dinitroanilin terikat secara kovalen dengan silika.

    L73 Partikel polidivinilbenzena bulat dan kaku, dengan diameter 5 sampai 10 µm.

    L74 Resin penukar anion kuat terbuat dari inti dengan ikatan silang tinggi partikel makropori diameter 7 µm, ukuran pori rata-rata 100 Å terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena  dan lapisan pertukaran anion pada permukaan, yang difungsikan dengan ion alkil amonium kuartener.

    L75 Bovine Serum Albumin (BSA) yang diketahui sebagai protein kiral, terikat secara kimia pada partikel silika, diameter lebih kurang 7 mm dan ukuran pori 300Å.

    L76 Basis silika, bahan penukar kation lemah, dengan diameter 5 µm. Substrat adalah asam maleat-polibutadiena terpolimer di permukaan untuk menghasilkan asam karboksilat fungsional. Kapasitas tidak kurang dari 29 µEq per kolom.

    L77 Resin penukar kation lemah terdiri dari etilvinilbenzena, 55% terikat silang dengan kopolimer divinilbenzena, dengan diameter 6 µm sampai 9 µm. Substrat adalah permukaan dengan penambahan gugus asam karboksilat fungsional. Kapasitas tidak kurang dari 500 µEq per kolom (4 mm × 25 cm).

    L78 Ligan silan yang terdiri dari fase balik (rantai alkil yang lebih panjang dari C8) dan gugus fungsional penukar anion (gugus amino primer, sekunder, atau tersier) terikat secara kimiawi pada silika berpori atau tidak berpori atau mikropartikel keramik, dengan diameter 1,0 µm sampai 50 µm, atau batang monolitik.

    L79 Human Serum Albumin (HSA) yang diketahui sebagai protein kiral, terikat secara kimia pada partikel silika, diameter lebih kurang 5 µm.

    L80 Partikel silika bulat berpori berlapis selulosa tris(4-metilbenzoat), diameter 5 µm sampai 20 µm.

    L81 Resin penukar anion kuat selektif terhadap hidroksida terbuat dari inti dengan ikatan silang tinggi partikel berpori diameter 9 µm, ukuran pori 2000 Å dan terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena dengan lapisan lateks mengandung butiran mikro dengan diameter 70 nm  (6% ikatan silang) yang terikat dengan  ion alkanol amonium kuartener.

    L82 Poliamina yang terikat secara kimia pada ikatan silang polimer polivinil alkohol, diameter 5µm.

    L83 Resin penukar anion kuat, amina kuarterner, selektif terhadap hidroksida, terikat pada partikel lateks pada inti partikel mikro pori dengan diameter 10,5 mm, ukuran pori 10 Angstrom dan mengandung ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena.

    L84 Resin penukar kation lemah terdiri dari etilvinilbenzena, 55% terikat silang dengan kopolimer divinilbenzena, dengan diameter 5 µm. Substrat adalah permukaan dengan penambahan gugus asam karboksilat fungsional. Kapasitas tidak kurang dari 8400 µEq per kolom (5 mm × 25 cm).

    L85 Ligan silan yang terdiri dari fase balik (rantai alkil yang lebih panjang dari C8) dan gugus fungsional penukar kation lemah (gugus karboksil) terikat secara kimia pada partikel berpori atau tidak berpori, dengan diameter 1,0 µm sampai 50 µm.

    L86 Partikel inti gabungan berdiameter 5 ?m  dengan ligan sangat polar yang memiliki 5 gugus hidroksil yang ditambatkan ke lapisan luar silika gel.

    L87 Dodesil silana yang terikat secara kimia pada partikel silika berpori, diameter 1,5 ?m sampai 10 ?m.

    L88 Glikopeptida vankomisin yang terhubung melalui ikatan kovalen ganda dengan silika bulat ukuran 100 Angstrom.

    L89 Resin polimetakrilat yang mempunyai ikatan silang dengan eter polihidroksil (permukaannya mengandung sedikit sisa gugus fungsi kationik), memiliki kemampuan untuk memisahkan senyawa-senyawa dengan bobot molekul 100 sampai 3000 (ditentukan sebagai polietilen oksida), yang dipakai untuk polimer larut air yang bersifat netral dan anionik.

    L90 Partikel silika bulat berpori disalut dengan amilosa tris-[(S)-alfa-metilbenzilkarbamat], diameter 3mm sampai 10mm.

    L91 Resin penukar anion kuat terdiri dari butiran polistirena/divinilbenzena monodispersi yang digabungkan dengan amina kuarterner. Ukuran butiran adalah 10 ?m.

    L92 Resin penukar anion kuat terbuat dari inti dengan ikatan silang tinggi partikel makropori diameter 5 µm sampai 9 µm, ukuran pori rata-rata 100 Å dan terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena  dan lapisan pertukaran anion pada permukaan, yang difungsikan dengan ion alkanol amonium kuartener.

    L93 Fase balik dengan fase diam kiral berisi selulosa tris(3,5-dimetilfenilkarbamat) yang disalut pada partikel silika gel, ukuran 3 ?m sampai 5 ?m.

    L94 Resin penukar anion kuat terdiri dari partikel mikropori ukuran 15 ?m dengan ikatan silang tinggi yang difungsikan dengan lateks ikatan silang sangat rendah (0,5%) untuk menyediakan situs pertukaran ion pada alkanol amonium kuarterner.

    L95 Suatu ligan alkil sangat polar terdiri dari 5 gugus hidroksil yang terikat secara kimia pada silika yang berpori seluruhnya atau berpori permukaan, atau batang silika monolitik.

    L96 Fase balik, rantai alkil yang terikat seluruhnya atau hanya permukaan pada silika berpori dengan diameter 1,5 ?m  sampai 10 ?m dirancang untuk menahan senyawa hidrofilik dan senyawa polar lainnya saat menggunakan fase gerak berair tinggi, termasuk 100% berair.

    L97 Resin penukar kation lemah terbuat dari inti dengan ikatan silang tinggi partikel berpori diameter 5,5 µm, ukuran pori 2000 Å unit dan terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena. Substrat adalah permukaan dengan penambahan gugus asam karboksilat fungsional. Kapasitas tidak kurang dari 2400 µEq per kolom (4 mm × 25 cm).

    L98 Resin penukar kation lemah terbuat dari inti dengan ikatan silang tinggi partikel mikropori diameter 8 µm, ukuran pori 10 Å unit dan terdiri dari ikatan silang etilvinilbenzena dengan 55% divinilbenzena. Substrat adalah permukaan dengan penambahan gugus asam karboksilat fungsional. Kapasitas tidak kurang dari 46 µEq per kolom (4 mm × 5 cm).

    L101 Gugus kolesteril yang terikat pada partikel mikro silika berpori atau tidak berpori atau partikel mikro keramik, dengan diameter 1,5 µm sampai 10 µm, atau batang monolitik.

Fase

    G1 Minyak dimetilpolisiloksan

    G2 Gom dimetilpolisiloksan

    G3 Fenil 50%-  metilpolisiloksan50%

    G4 Poliester dietilen glikol suksinat

    G5 3-sianopropilpolisiloksan

    G6 Trifluoropropilmetilpolisiloksan

    G7 3-sianopropil 50%-  fenilmetilsilikon 50%

    G8 bis (3-sianopropil) 80% - 3-sianopropil fenil polisiloksan 20% (persen menyatakan substitusi molar)

    G9 Metilvinilpolisiloksan

    G10 Poliamida yang dibentuk dengan mereaksikan C₃₆ asam dikarboksilat dengan 1,3-di-4-piperidilpropan dan piperidin dalam perbandingan molekul 1,00: 0,90: 0,20.  

    G11 Poliester bis(2-etilheksil)sebakat.

    G12 Poliester fenildietanolamina suksinat.

    G13 Sorbitol

    G14 Polietilen glikol (bobot molekul rata-rata 950 sampai 1050)

    G15 Polietilen glikol (bobot molekul rata-rata 3000 sampai 3700)

    G16 Senyawa polietilen glikol (bobot molekul rata-rata lebih kurang 15.000). Suatu senyawa berbobot molekul tinggi yang terbentuk dari polietilen glikol dengan suatu ikatan diepoksida.

    G17 Fenil 75% -  metilpolisiloksan 25%

    G18 Polialkilen glikol

    G19 Fenil 25%  -  sianopropil 25%  -  metilsilikon 50%.

    G20 Polietilen glikol (bobot molekul rata-rata 380 sampai 420).

    G21 Neopentil glikol suksinat.

    G22 Bis(2-etilheksil)ftalat.

    G23 Polietilen glikol adipat.

    G24 Diisodesil ftalat.

    G25 Senyawa polietilen glikol TPA. Suatu senyawa berbobot molekul tinggi yang terbentuk dari suatu polietilen glikol dan suatu diepoksida yang diesterkan dengan asam tereftalat.

    G26 2-sianoetil 25% -  metilpolisiloksan75%

    G27 Fenil 5% - metilpolisiloksan 95%

    G28 Fenil 25% -  metilpolisiloksan75%

    G29 3,3'-Tiodipropionitril

    G30 Tetraetilen glikol dimetil eter

    G31 Nonilfenoksipoli(etilenoksi)etanol (panjang rantai etilenoksi rata-rata 30); Nonoksinol 30.

    G32 Fenilmetil 20% -  dimetilpolisiloksan 80%

    G33 Karboran 20% -  metilsilikon 80%

    G34 Poliester dietilen glikol suksinat yang dibuat stabil dengan asam fosfat.

    G35 Suatu senyawa berbobot molekul tinggi yang terbentuk dari suatu polietilen glikol dan suatu diepoksida yang diesterkan dengan asam nitrotereftalat.

    G36 Vinil 1% - fenilmetilpolisiloksan 5%

    G37 Poliimida

    G38 Fase G1 yang mengandung sejumlah kecil persentase penghambat pembentukan faktor ikutan.

    G39 Polietilen glikol (bobot molekul rata-rata lebih kurang 1500)

    G40 Etilenglikol adipat

    G41 Fenilmetildimetilsilikon (tersubsitusi fenil sebanyak 10%)

    G42 Fenil 35%- dimetilpolisiloksan 65% (persen menyatakan substitusi molar)

    G43 Sianopropilfenil 6% - dimetilpolisiloksan 94%  (persen menyatakan substitusi molar).

    G44 Petrolatum hidrokarbon berbobot molekul rendah 2% dan 1% larutan kalium hidroksida .

    G45 Divinilbenzena-etilen glikol-dimetilakrilat

    G46 Sianopropilfenil 14% - metilpolisiloksan 86%

    G47 Polietilen glikol (bobot molekul rata-rata lebih kurang 8000)

    G48 Sianopolisiloksan berikatan silang sebagian dan bersifat sangat polar.

Penyangga

[Catatan jika tidak disebutkan lain, ukuran yang dimaksud adalah 80 mesh sampai 100 mesh atau sebagai alternatif 100 mesh sampai 120 mesh.]

    S1A Tanah silika untuk kromatografi gas, yang telah diflukskalsinasikan dengan jalan mencampurkan diatomit dengan natrium karbonat serta dikalsinasikan di atas suhu 900°. Tanah silika tersebut dicuci dengan asam, kemudian dicuci dengan air sampai netral, tetapi tidak dicuci dengan basa. Tanah silika itu dapat disilanisasikan dengan jalan diberi perlakuan dengan suatu pereaksi, seperti dimetildiklorosilan, untuk menutupi gugus silanol yang terdapat pada permukaan. Jika tidak disebutkan lain dalam monografi, yang dimaksudkan adalah penyangga yang tersilanisasi.

    S1AB Tanah silika seperti yang disebutkan di atas dicuci dengan asam dan basa. Jika tidak disebutkan lain dalam monografi, yang dimaksudkan adalah penyangga yang tersilanisasi.

    S1C Penyangga yang terbuat dari bata tahan api yang dihancurkan serta dikalsinasikan atau dibakar dengan pengikat tanah liat diatas suhu 900°, diikuti pencucian memakai asam, dan dapat disilanisasikan.

    SID Penyangga yang terbuat dari bata tahan api yang dihancurkan serta dikalsinasikan atau dibakar dengan pengikat tanah liat diatas suhu 900°, tidak dicuci dengan asam dan dan dapat disilanisasikan.

    S1NS Tanah silika tanpa perlakuan.

    S2 Kopolimer stirena-divinilbenzena dengan luas permukaan nominal kurang dari 50 m² per g dan diameter pori rata-rata 0,3 mm sampai 0,4 mm.

    S3 Kopolimer dari etildivinilbenzena dan divinilbenzena dengan luas permukaan nominal 500 m² sampai 600 m² per g dan diameter pori rata-rata 0,0075 mm

    S4 Kopolimer stirena-divinilbenzena dengan gugus -O- dan -N aromatik, yang mempunyai luas permukaan nominal 400 m² sampai 600 m² per g dan diameter pori rata-rata 0,0076 mm.

    S5 Polimer tetrafluoroetilen dengan bobot molekul tinggi dan ukuran 40 mesh sampai 60 mesh.

    S6 Kopolimer stirena-divinilbenzena dengan luas permukaan nominal 250 m² sampai 350 m² per g dan diameter pori rata-rata 0,0091mm

    S7 Karbon grafit dengan luas permukaan nominal 12 m² per g.

    S8 Kopolimer 4-vinil-piridin dan stirenadivinil benzena.

    S9 Polimer berpori dari 2,6-difenil-p-fenilen oksida.

    S10 Kopolimer berikatan silang akrilonitril dan divinilbenzena yang bersifat sangat polar.

    S11 Karbon grafit dengan luas permukaan nominal 100 m² per g, yang dimodifikasi dengan sedikit vaselin dan senyawa polietilen glikol.

    S12 Karbon grafit dengan luas permukaan nominal 100 m² per g.