Baku Pembanding Kalsium Pantotenat BPFI; lakukan pengeringan pada suhu 105° selama 3 jam sebelum digunakan. Simpan dalam wadah tertutup rapat dalam lemari pendingin.

    Larutan baku persediaan Timbang saksama lebih kurang 50 mg Kalsium Pantotenat BPFI  yang telah dikeringkan dan disimpan di tempat gelap, diatas fosfor pentoksida P, hindari penyerapan uap air selama penimbangan. Larutkan dengan lebih kurang 500 mL air dalam labu tentukur 1000-mL. Tambahkan 10 mL asam asetat 0,2 N dan 100 mL larutan natrium asetat P (1 dalam 60), encerkan dengan air sampai tanda. Tiap mL larutan setara dengan 50 µg Kalsium Pantotenat BPFI. Simpan di bawah lapisan toluena P dalam lemari pendingin.

    Larutan baku Pada hari pengujian, pipet sejumlah Larutan baku persediaan encerkan dengan air hingga kadar antara 0,01 µg dan 0,04 µg kalsium pantotenat per mL, gunakan kadar yang tepat hingga respons yang diperoleh seperti tertera pada Prosedur, 2,0 mL dan 4,0 mL Larutan baku yang digunakan, berada dalam garis lurus kurva respons log-kadar.

    Larutan uji Buat larutan seperti tertera pada masing-masing monografi dengan kadar setara kalsium pantotenat dalam Larutan baku.

    Larutan persediaan media basal

    Larutkan dekstrosa anhidrat dan natrium asetat dalam larutan yang dicampur terdahulu, atur pH 6,8 dengan penambahan natrium hidroksida 1 N, encerkan dengan air hingga 250 mL.

    Larutan kasein terhidrolisis asam Campur 100 g kasein P bebas vitamin dengan 500 mL asam hidroklorida  6 N dan refluks campuran selama 8 sampai 12 jam. Hilangkan asam hidroklorida dalam campuran dengan penyulingan pada tekanan rendah hingga sisa berbentuk pasta kental. Larutkan kembali pasta yang terbentuk dengan air, atur pH 3,5 ± 0,1 dengan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air hingga 1000 mL. Tambahkan 20 g arang aktif P, aduk selama 1 jam dan saring. Ulangi perlakuan dengan arang aktif. Simpan di bawah toluena P dalam lemari pendingin pada suhu tidak kurang dari 10º. Saring larutan jika pada waktu penyimpanan terbentuk endapan.

    Larutan sistin-triptofan Suspensikan 4,0 g L-sistin P dan 1,0 g L-triptofan P (atau 2,0 g D,L-triptofan) dalam 700 mL sampai 800 mL air, panaskan pada suhu 70º hingga 80º dan tambahkan larutan asam hidroklorida P (1 dalam 2) tetes demi tetes dengan pengadukan sampai padatan larut. Simpan di bawah lapisan toluena P dalam lemari pendingin pada suhu tidak kurang dari 10º.

    Larutan adenin-guanin-urasil Larutkan dengan pemanasan adenin sulfat P, guanin hidroklorida P dan urasil P masing-masing 200 mg dalam 10 mL asam hidroklorida 4 N, dinginkan dan tambahkan air hingga 200 mL. Simpan di bawah lapisan toluena dalam lemari pendingin.

    Larutan polisorbat 80 Larutkan 25 g polisorbat 80 P dalam etanol P hingga 250 mL.

    Larutan riboflavin-tiamin hidroklorida-biotin Buat larutan dalam asam asetat 0,02 N hingga tiap mL mengandung masing-masing 20 µg riboflavin P, 10 µg tiamin hidroklorida P dan 0,04 µg biotin P. Simpan di bawah lapisan toluena dalam lemari pendingin.

    Larutan asam para aminobenzoat - niasin - piridoksin hidroklorida Buat larutan dalam etanol P 25% netral hingga tiap mL mengandung 10 µg asam p-aminobenzoat P, 50 µg niasin P dan 40 µg piridoksin hidroklorida P. Simpan dalam lemari pendingin.

    Larutan garam A Larutkan 25 g kalium fosfat monobasa P dan 25 g kalium fosfat dibasa P dalam air hingga 500 mL. Tambahkan 5 tetes asam hidroklorida P, simpan di bawah lapisan toluena.

    Larutan garam B Larutkan 10 g magnesium sulfat P dan 500 mg natrium klorida P, 500 mg besi (II) sulfat P dan 500 mg mangan sulfat P dalam air hingga 500 mL. Tambahkan 5 tetes asam hidroklorida P, simpan di bawah lapisan toluena.

    Biakan persediaan lactobacillus plantarum Larutkan 2,0 g ekstrak ragi P  larut air dalam 100 mL air, tambahkan 500 mg dekstrosa anhidrat P, 500 mg natrium asetat anhidrat P dan 1,5 g agar P, panaskan campuran di atas tangas uap sambil diaduk hingga agar terlarut. Tuang masing-masing lebih kurang 10 mL larutan agar panas ke dalam tabung reaksi, tutup tabung, sterilkan pada suhu 121º, biarkan tabung mendingin dalam posisi tegak. Buat biakan dari biakan murni Lactobacillus plantarum dengan tusukan pada tiga atau lebih tabung reaksi. Inkubasi selama 16 sampai 24 jam pada suhu antara 30º dan 37±0,5º kemudian simpan dalam lemari pendingin. Buat biakan segar dari biakan persediaan setiap minggu dan tidak boleh digunakan sebagai inokulum bila umur biakan lebih dari 1 minggu.

    Media biakan Pada tiap seri tabung berisi 5,0 mL Larutan persediaan media basal tambahkan 5,0 mL air yang mengandung 0,2 µg kalsium pantotenat. Sumbat tabung dengan kapas, sterilkan dengan otoklaf pada suhu 121º dan dinginkan.

    Inokula Pindahkan sel dari Biakan persediaan lactobacillus plantarum ke dalam tabung steril berisi 10 mL Media biakan. Inkubasi biakan selama 16 hingga 24 jam pada suhu yang dipilih antara 30º dan 37º±0,5º. Suspensi sel yang diperoleh adalah Inokula.

    Prosedur Pada dua seri tabung reaksi ukuran sama masukkan 1,0 mL dan/atau 1,5 mL; 2,0 mL; 3,0 mL; 4,0 mL dan 5,0 mL Larutan baku. Pada tiap tabung dan 4 tabung sejenis yang tidak berisi Larutan baku tambahkan 5,0 mL Larutan persediaan media basal dan air secukupnya hingga 10 mL. Pada dua seri tabung reaksi sejenis masukkan sejumlah  Larutan uji setara dengan 3 atau lebih tingkat kadar Larutan baku meliputi tingkat 2,0 mL; 3,0 mL dan 4,0 mL. Pada masing-masing tabung tambahkan 5,0 mL Larutan persediaan media basal dan air secukupnya hingga 10 mL. Tempatkan dua seri tabung Larutan baku  dan Larutan uji bersama-sama dalam rak tabung dan sebaiknya tempatkan tabung secara acak.

    Tutup tabung untuk mencegah kontaminasi jasad renik dan panaskan dalam otoklaf pada suhu 121º selama 5 menit. Dinginkan dan tambahkan 1 tetes inokula pada tiap tabung kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi Larutan baku (sebagai blangko yang tidak diinokulasi) dan campur. Inokulasi tabung pada suhu antara 30º dan 37º±0,5º selama 16 hingga 24 jam, sampai tidak terbentuk penambahan kekeruhan pada tabung yang mengandung baku kadar tertinggi dalam waktu 2 jam.

    Tentukan transmitans tabung denga cara sebagai berikut: Campur isi tiap tabung, ukur transmitans pada panjang gelombang antara 540 nm dan 660 nm, setelah tercapai keadaan stabil. Keadaan stabil dicapai beberapa detik setelah dikocok, bila pembacaan transmitans stabil selama 30 detik atau lebih. Gunakan interval waktu yang relatif sama untuk setiap pembacaan tabung.

    Atur transmitans 1,00 menggunakan blangko yang tidak diinokulasi, ukur transmitans blangko terinokulasi. Dengan transmitans 1,00 untuk blangko terinokulasi, ukur transmitans tabung-tabung lain. Jika terjadi kontaminasi dengan jasad renik asing, ulangi pengujian.

    Perhitungan Buat kurva baku antar kadar dan respons dengan cara sebagai berikut: Untuk tiap tingkat kadar Larutan baku, hitung respons dari jumlah harga duplikasi transmitans (?) sebagai selisih, Y = 2,00 - ?(dari transmitans). Gambarkan kurva dengan respons pada ordinat kertas grafik terhadap log dari volume Larutan baku dalam mL tiap tabung pada absis, untuk ordinat menggunakan skala aritmetika atau logaritmik sehingga diperoleh mendekati garis lurus. Gambar garis lurus atau kurva yang paling sesuai dengan titik yang diperoleh.

    Hitung respons y dengan menambah bersama dua transmitans untuk tiap kadar Larutan uji. Baca dari kurva baku logaritma volume Larutan baku yang sesuai untuk  tiap harga y yang terletak pada rentang titik terendah dan tertinggi dari baku. Kurangkan dari tiap logaritma yang diperoleh, logaritma dari volume dalam mL Larutan uji untuk memperoleh perbedaan, x, untuk tiap tingkat dosis. Harga rata-rata x untuk masing-masing tiga atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh x = M’, log-potensi relatif Larutan uji. Hitung jumlah dalam mg Kalsium Pantotenat BPFI  yang sesuai dengan kalsium pantotenat dalam sejumlah bahan yang digunakan untuk pengujian sebagai antilog:

M = antilog (M’ + log R)

R adalah jumlah mg kalsium pantotenat yang diperkirakan ada dalam tiap mg (kapsul atau tablet) yang digunakan untuk pengujian.

    Pengulangan Ulangi seluruh penetapan sekurang-kurangnya satu kali, dengan Larutan uji yang dibuat terpisah. Jika perbedaan antara dua log-potensi M tidak lebih dari 0,08, harga rata-rata M adalah log- potensi sediaan uji seperti tertera pada Rentang dan batas keyakinan dari potensi dalam Desain analisis Penetapan Hayati <81>. Jika dua penetapan berbeda lebih dari 0,008 lakukan satu atau lebih penetapan tambahan. Dari harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak berbeda lebih dari 0,15, hitung potensi rata-rata Larutan uji.