Semua penetapan radioaktif yang menggunakan metode ini harus dilakukan dengan alat pencacah yang sesuai, dan dalam jangka waktu optimal untuk alat pencacah tersebut. Semua prosedur harus dilakukan pengulangan untuk mendapatkan ketepatan yang tinggi.
Baku pembanding Sianokobalamin BPFI; lakukan pengeringan di atas silika gel P selama 4 jam sebelum digunakan.
Pereaksi perunut sianokobalamin Ukur saksama sejumlah volume larutan sianokobalamin radioaktif, encerkan dengan air hingga larutan mempunyai radioaktivitas antara 500 dan 5000 cacahan per menit per mL larutan, tambahkan 1 tetes kresol P per liter larutan dan simpan dalam lemari pendingin.
Pembakuan Timbang saksama sejumlah Sianokobalamin BPFI, dan larutkan dalam air hingga kadar 20 µg hingga 50 µg per mL. Lakukan seluruh prosedur penetapan pada 10,0 mL larutan seperti tertera pada Larutan uji, mulai dari “Tambahkan air hingga volume” .
Larutan kresol-karbon tetraklorida Buat campuran dalam volume yang sama karbon tetraklorida P dengan kresol P yang baru di destilasi.
Larutan fosfat-sianida Larutkan 100 mg kalium sianida P dalam 1000 mL larutan jenuh natrium fosfat dibasa P.
Larutan butanol-benzalkonium klorida Encerkan larutan benzalkonium klorida P (17 dalam 100) dengan air (3:1), campur dengan 36 volume butanol P.
Kolom alumina-resin Masukkan segumpal wol kaca ke dalam dasar kolom 50 mL, masukkan sejumlah bubur resin penukar ion P dalam air ke dalam kolom hingga setinggi 7 cm. Bila resin sudah mengendap, biarkan air menetes hingga tinggi air di atas kolom resin tinggal 1 cm; padatkan perlahan kolom resin. Tambahkan sejumlah volume bubur alumina anhidrat P (tanpa pencucian asam) dalam air secukupnya sampai tinggi kolom menjadi 10 cm, keluarkan air hingga tinggal 1 cm di atas kolom alumina. Tutup dengan wol kaca, cuci kembali kolom dengan 50 mL air, dan buang air hingga tinggi air di atas kolom tinggal 1 cm. Buat kolom baru untuk setiap penetapan.
Larutan uji Timbang atau ukur saksama sejumlah zat dengan aktivitas vitamin B12, setara dengan 200 µg hingga 500 µg sianokobalamin, masukkan ke dalam gelas piala. Tambahkan air hingga volume tidak kurang dari 25 mL, tambahkan 5 mL Pereaksi perunut sianokobalamin. Tambahkan 5 mg natrium nitrit P dan 2 mg kalium sianida P pada tiap mL larutan yang dihasilkan. Lakukan penambahan dalam lemari asam. Atur pH hingga 4 dengan penambahan asam hidroklorida encer P, panaskan di atas tangas uap selama 15 menit. Dinginkan dan atur pH hingga antara 7,6 dan 8,0 dengan penambahan natrium hidroksida 1 N. Sentrifus atau saring untuk membuang bagian padat yang tidak larut.
Prosedur Masukkan Larutan uji ke dalam tabung sentrifuga 250 mL, tambahkan 10 mL Larutan kresol karbon tetraklorida, tutup tabung dengan sumbat kaca, polietilen atau karet yang dilapisi dengan kertas logam, kocok kuat selama 2 menit hingga 5 menit, dan sentrifus, ambil larutan bagian bawah. Ulangi ekstraksi menggunakan 5 mL Larutan kresol-karbon tetraklorida, dan gabungkan ekstrak larutan bagian bawah ke dalam tabung sentrifus atau corong pisah kapasitas 50 mL hingga 100 mL.
Cuci gabungan ekstrak beberapa kali, tiap kali dengan 1 mL asam sulfat 5 N sampai cucian terakhir praktis tidak berwarna, (biasanya cukup dua kali). Selama tiap pencucian kocok 2 menit hingga 5 menit, diamkan sampai terpisah, bila perlu sentrifus, dan buang lapisan asam. Cuci kembali 2 kali, tiap kali dengan 10 mL Larutan fosfat sianida. Terakhir cuci dengan 10 mL air. Buang semua cairan pencuci.
Pada ekstrak yang sudah dicuci, tambahkan 30 mL campuran Larutan butanol-benzalkonium klorida dan karbon tetraklorida P (2:1). Ekstraksi dua kali, tiap kali dengan 5 mL air, tiap kali kocok kuat selama 1 menit, sentrifus, ambil dan simpan lapisan air. Lewatkan campuran ekstrak air melalui kolom alumina-resin, dengan kecepatan lebih kurang 1 mL per menit, dengan menjaga tinggi lapisan cairan 1 cm di atas kolom dengan menambahkan air secukupnya. Buang eluat awal yang tidak berwarna (biasanya lebih kurang 5 mL), dan kumpulkan eluat berwarna (biasanya lebih kurang 10 mL) ke dalam tabung sentrifus atau corong pisah 50 mL yang berisi 500 µl asam asetat encer P. Ekstraksi eluat dengan cara mengocok selama 2 menit sampai 5 menit dengan 5 mL Larutan kresol karbon tetraklorida, kemudian buang lapisan air yang diatas. Ke dalam ekstrak tambahkan 5,0 mL air, 5 mL karbon tetraklorida P dan 10 mL butanol P. Kocok, diamkan sampai lapisan atas jernih dan pindahkan lapisan air yang di atas. Ukur serapan ekstrak air pada 361 nm dan 550 nm dengan spektrofotometer. Pada pembacaan 361 nm gunakan filter untuk mengurangi sinar bias. Hitung perbandingan A361/A550; kemurnian ekstrak air memenuhi syarat bila perbandingan antara 3,10 dan 3,40. Bila perbandingan di luar nilai tersebut ulangi pemurnian ekstrak air dengan mengulangi siklus ekstraksi dan lanjutkan pengujian sebagai berikut.
Bila perbandingan serapan dalam ekstrak air memenuhi syarat, tetapkan radioaktivitas dalam cacahan per menit, menggunakan alat pencacah yang sesuai dalam waktu optimal untuk alat pencacah tersebut. Hitung hasil rata-rata, dan koreksi terhadap latar belakang radioaktivitas yang ditetapkan dua kali atau lebih selama waktu 30 menit.
Perhitungan Hitung kandungan kobalamin yang dinyatakan dalam µg sianokobalamin dengan rumus:
R adalah jumlah µg sianokobalamin dalam Larutan baku yang digunakan; Cs dan Cu berturut-turut adalah nilai radioaktivitas rata-rata yang telah dikoreksi, dinyatakan dalam cacahan per menit per mL dari Larutan baku dan Larutan uji; Au dan As berturut-turut adalah serapan pada 361 nm dari Larutan uji dan Larutan baku.