Uji endotoksin bakteri adalah uji untuk mendeteksi atau mengkuantitasi endotoksin bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel yang diuji. Pengujian dilakukan menggunakan Limulus Amebocyte Lysate (LAL) yang diperoleh dari ekstrak air amebosit dalam kepiting ladam kuda (Limulus polyphemus atau Tachypleus tridentatus) dan dibuat khusus sebagai pereaksi LAL. [Catatan: Pereaksi LAL bereaksi dengan beberapa ?-glukan bila ditambahkan pada endotoksin. Beberapa sediaan yang  diperlakukan tidak bereaksi dengan ?-glukan dan harus digunakan untuk contoh yang mengandung glukan.]

    Terdapat dua tipe teknik uji, teknik pembentukan jendal gel dan teknik fotometrik. Teknik fotometrik  mencakup metode turbidimetri, yang didasarkan pada pembentukan kekeruhan setelah penguraian substrat endogen, dan metode kromogenik yang didasarkan pada pembentukan warna setelah terjadi penguraian kompleks kromogen-peptida sintetik. Lakukan salah satu dari teknik tersebut, kecuali jika dinyatakan lain dalam monografi. Jika terjadi keraguan, maka keputusan akhir didasarkan pada hasil Teknik Pembentukan Jendal Gel, kecuali dinyatakan lain dalam monografi.  

    Pada Teknik Pembentukan Jendal Gel, penetapan titik akhir reaksi dilakukan  dengan membandingkan langsung enceran dari zat uji dengan enceran endotoksin baku, dan jumlah endotoksin dinyatakan dalam unit Endotoksin (UE).

    Pereaksi LAL diformulasikan juga untuk digunakan dalam pengujian turbidimetri dan kolorimetri, maka pengujian-pengujian tersebut dapat digunakan untuk memenuhi persyaratan yang ditetapkan.  Kedua uji ini memerlukan pembuatan kurva regresi baku dan kandungan endotoksin dari zat uji ditetapkan dengan interpolasi dari kurva tersebut. Prosedur meliputi inkubasi selama  waktu yang telah ditetapkan dari endotoksin yang bereaksi dan larutan kontrol dengan pereaksi LAL, dan pembacaan serapan cahaya pada panjang gelombang yang sesuai. Pengukuran titik akhir pada prosedur secara turbidimetri, pembacaan dilakukan segera pada akhir masa inkubasi. Pengukuran titik akhir pada prosedur secara kolorimetri,  reaksi dihentikan  pada akhir dari waktu yang telah ditetapkan, dengan penambahan zat pemutus-reaksi-enzim, sebelum pengukuran. Pada penetapan kadar secara kinetik (turbidimetri dan kolorimetri), serapan diukur selama periode reaksi dan dari pengukuran tersebut ditetapkan nilai kecepatan reaksi.

ALAT DAN ALAT GELAS 

    Depirogenasi seluruh peralatan gelas dan bahan tahan panas lainnya dalam oven udara panas menggunakan proses yang telah divalidasi. [Catatan: Prosedur untuk uji validasi inaktifasi endotoksin, lihat Sterilisasi Pemanasan Kering dalam Sterilisasi dan  Jaminan Sterilitas untuk Bahan Kompendial <1371>. Gunakan pereaksi LAL dengan sensitivitas tidak kurang dari 0,15 UE per mL]

    Umumnya waktu dan suhu minimum yang digunakan adalah 30 menit pada 250°. Jika menggunakan Peralatan plastik, misalnya microplate dan pipet tips untuk pipet otomatis, gunakan hanya yang sudah dibuktikan bebas endotoksin dan tidak akan mengganggu pengujian. [Catatan: Pada bagian ini, istilah tabung dimaksudkan untuk semua wadah , misalnya sumur mikro-titer].

PENYIAPAN LARUTAN INDUK BAKU PEMBANDING DAN LARUTAN BAKU PEMBANDING ENDOTOKSIN 

    Baku pembanding endotoksin (BPE) adalah Endotoksin BPFI yang telah diketahui potensinya dalam UE per vial. Konstitusi seluruh isi vial BPE dengan 5,0 mL air pereaksi LAL³⁾. [Catatan - Air pereaksi LAL adalah air untuk injeksi atau air lain yang tidak bereaksi dengan pereaksi LAL yang digunakan pada batas kepekaan pereaksi].

Campur dengan pengocok vorteks secara intermiten selama 30 menit. Gunakan larutan pekat ini untuk membuat seri pengenceran yang sesuai. Simpan larutan pekat dalam lemari pendingin, selama  tidak lebih dari 14 hari untuk membuat pengenceran berikutnya. Sebelum digunakan kocok kuat dengan pengocok vorteks selama tidak kurang dari 3 menit. Campur setiap enceran tidak kurang dari 30 detik sebelum membuat pengenceran berikutnya. Enceran tidak boleh disimpan karena menyebabkan hilangnya aktivitas oleh penyerapan, kecuali ada data penunjang tentang hal ini.

Uji Persiapan

    Gunakan Pereaksi LAL yang sudah ditetapkan kepekaannya sesuai dengan yang tertera pada etiket.

    Keabsahan hasil uji untuk endotoksin bakteri ini memerlukan pembuktian yang cukup bahwa contoh bahan atau larutan, pencuci, atau ekstrak yang digunakan pada uji, tidak menghambat atau memacu reaksi atau dapat mengganggu pengujian dengan cara apapun. Validasi dilakukan dengan Uji penghambatan atau pemacuan sebagaimana yang diuraikan pada 3 teknik yang telah disebutkan sebelumnya. Dalam uji ini harus dimasukkan  kontrol negatif yang sesuai. Validasi harus diulang jika sumber Pereaksi LAL atau metode pembuatan atau formulasi bahan berubah.

Penyiapan Larutan Uji

    Siapkan larutan uji dengan melarutkan atau   mengencerkan obat, atau  mengekstraksi  alat kesehatan dengan Air Pereaksi LAL. Beberapa bahan atau sediaan mungkin lebih baik dilarutkan, diencerkan atau diekstraksi dalam larutan mengandung air lainnya. Jika perlu, atur pH larutan (atau hasil pengencerannya) yang akan diuji hingga pH campuran pereaksi LAL dan larutan uji terletak pada rentang pH yang ditentukan oleh produsen pereaksi LAL. Hal ini biasanya digunakan pada produk dengan rentang pH 6,0-8,0. Pengaturan pH dapat dilakukan dengan menggunakan asam, basa atau larutan dapar yang sesuai dengan rekomendasi produsen pereaksi LAL. Asam dan basa dapat dibuat dari konsentrat atau padatan dengan Air Pereaksi LAL dalam wadah bebas endotoksin. Larutan dapar harus divalidasi bebas endotoksin dan faktor pengganggu.

PENETAPAN PENGENCERAN MAKSIMUM YANG ABSAH (PMA) 

    Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA) adalah pengenceran maksimum yang diperbolehkan dari suatu contoh agar batas endotoksinnya dapat ditetapkan. Pengenceran Maksimum yang Absah diberlakukan untuk injeksi atau larutan parenteral terkonstitusi atau diencerkan, atau jika diperlukan, untuk jumlah obat dalam bobot jika volume obat yang diberikan bervariasi.  Persamaan umum untuk menentukan PMA adalah:

    PMA = (batas endotoksin x konsentrasi larutan sampel)/l

l adalah kepekaan Pereaksi LAL yang tertera pada etiket (UE/mL).

Hubungan konsentrasi larutan sampel dan l dijelaskan di bawah ini :

-  Jika batas endotoksin dalam monografi dinyatakan dalam konsentrasi (UE/mL), maka PMA dapat dihitung dengan rumus: 

PMA = batas endotoksin (UE/mL) / ?

-  Jika batas endotoksin dalam monografi dinyatakan dalam UE/mg atau UE/Unit, maka PMA dapat dihitung dengan rumus umum tersebut di atas,

PMA = (batas endotoksin x konsentrasi sampel)/ ?

PMA yang diperoleh adalah batas pengeceran yang diperbolehkan untuk uji yang absah.

Konsentrasi sample dengan satuan (mg/mL atau Unit/mL).

PENETAPAN BATAS ENDOTOKSIN

    Batas endotoksin obat parenteral, ditetapkan berdasarkan dosis, sama dengan K/M.[Catatan: K adalah 5 UE per kg untuk semua cara pemberian selain dari intratekal (K adalah 0,2 UE per kg berat badan). Untuk sediaan radiofarmaka yang tidak diberikan secara intratekal, batas endotoksin dihitung sebagai 175/V, V adalah dosis maksimum dalam mL yang direkomendasikan. Untuk sediaan radiofarmaka yang diberikan secara intratekal. Batas endotoksin ditetapkan dengan rumus 14/V. Untuk formulasi (biasanya produk antikanker) diberikan berdasarkan pada m2 luas permukaan tubuh, dengan rumus K/M, K= 5 UE per kg dan M adalah (dosis maksimum/m2/jam x 1,80 m2)/ 70 kg.] K adalah dosis ambang pirogenik endotoksin pada manusia per kgberat badan, dan M sama dengan dosis maksimum produk pada manusia per kg berat badan dalam periode satu jam. Dalam masing-masing monografi, batas endotoksin obat parenteral  dinyatakan dalam unit, misalnya UE/mL, UE/mg atau UE/unit aktivitas biologi.

CARA JENDAL GEL 

     Cara jendal gel mendeteksi atau mengkuantitasi endotoksin berdasarkan pembentukan jendal dari pereaksi LAL dengan adanya endotoksin. Konsentrasi endotoksin yang dibutuhkan untuk menyebabkan lysate menjendal pada kondisi standar dinyatakan sebagai kepekaan pereaksi LAL yang tertera pada etiket. Untuk menjamin presisi dan keabsahan pengujian, lakukan uji konfirmasi kepekaan pereaksi LAL yang tercantum dalam etiket dan uji faktor pengganggu seperti tertera dalam Uji  Persiapan untuk Cara Jendal Gel .

Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel 

    Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL Lakukan konfirmasi kepekaan pereaksi yang tertera pada etiket menggunakan tidak kurang dari 1 vial untuk setiap lot pereaksi LAL. Buat pengenceran seri kelipatan 2 dari BPE dalam Air Pereaksi LAL hingga konsentrasi 2l; l; 0,5l; dan 0,25l. l adalah kepekaan pereaksi LAL yang tertera pada etiket (UE/mL). Lakukan uji pada 4 konsentrasi  larutan baku, dalam 4 replikasi termasuk kontrol negatif. Uji konfirmasi kepekaan lysate dilakukan bila menggunakan pereaksi LAL bets baru atau bila ada perubahan dalam kondisi uji yang dapat mempengaruhi hasil uji.

    Campur pereaksi LAL dengan larutan baku dari masing-masing konsentrasi dalam tabung uji dengan volume yang sama (0,1 mL). Jika digunakan vial atau ampul uji tunggal berisi pereaksi LAL kering beku, tambahkan larutan langsung ke dalam vial atau ampul. Inkubasi campuran reaksi dalam waktu yang tetap sesuai dengan petunjuk produsen pereaksi LAL (biasanya 37 ± 1°, selama 60 ± 2 menit), hindari getaran. Untuk menguji integritas gel, ambil setiap tabung langsung dari inkubator dan balikkan 180° secara perlahan-lahan. Jika telah terbentuk gel yang kuat, yang tetap di tempatnya walaupun telah dibalik, catat sebagai hasil positif. Jika gel tidak terbentuk atau gel yang terbentuk jatuh ketika dibalik, maka hasil dinyatakan negatif. Uji dinyatakan absah, jika larutan baku konsentrasi terrendah memberikan hasil negatif pada semua replikasi uji.

    Titik akhir adalah konsentrasi terendah yang masih memberikan hasil positif dari satu pengenceran seri.

    Hitung nilai rata-rata dari logaritma konsentrasi titik akhir, e, dan hitung antilogaritma dari nilai rata-rata menggunakan rumus berikut:

Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir = antilog (åe/f)

åe adalah jumlah logaritma konsentrasi titik akhir dari pengenceran seri yang digunakan; dan f adalah jumlah replikasi. Rata-rata geometri konsentrasi titik akhir adalah hasil pengukuran kepekaan pereaksi LAL (UE/mL). Jika hasil pengukuran kepekaan tidak kurang dari 0,5l dan tidak lebih dari 2l, maka kepekaan yang tercantum di etiket sesuai dan  dapat digunakan dalam pelaksanaan pengujian dengan lysate.

    Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Jendal Gel.  Siapkan larutan A, B, C, dan D seperti tertera pada Tabel 1 dan lakukan uji penghambatan atau pemacuan pada larutan sampel yang diencerkan kurang dari PMA, tidak mengandung endotoksin, dan ikuti prosedur dalam Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir dari larutan B dan C, ditetapkan dengan menggunakan persamaan uji di atas.

    Uji ini harus diulang apabila terjadi perubahan kondisi yang dapat mempengaruhi hasil uji. Uji dinyatakan absah apabila larutan A dan D memberikan hasil negatif,  dan hasil larutan C sesuai dengan kepekaan yang tertera pada etiket.

    Jika kepekaan lysate yang diperoleh dalam larutan uji pada larutan B tidak kurang dari 0,5l dan tidak lebih dari 2l, maka larutan uji tidak mengandung faktor pengganggu pada kondisi uji  yang digunakan. Jika sebaliknya, berarti terdapat faktor penggangu.

    Jika sampel yang diuji tidak memberikan hasil yang sesuai pada pengenceran yang digunakan ,ulangi uji menggunakan pengenceran yang lebih besar, tetapi tidak boleh melebihi PMA. Bila digunakan lysate yang lebih peka, maka pengenceran sampel lebih besar, dan dalam hal ini dapat mengurangi pengganggu.

    Gangguan dapat diatasi dengan penanganan yang sesuai misalnya penyaringan, netralisasi, dialisis, atau pemanasan. Untuk memastikan bahwa penanganan yang dipilih efektif menghilangkan gangguan tanpa menghilangkan endotoksin, lakukan pengujian di bawah ini menggunakan sediaan uji dengan penambahan BPE sesuai dengan perlakuan yang dipilih.

Uji  Batas Jendal Gel 

    Uji ini dilakukan bila dalam monografi disebutkan batas endotoksin.

    Prosedur Siapkan larutan A, B, C dan D seperti tertera pada Tabel 2 dan lakukan pengujian larutan ini mengikuti prosedur  Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara Jendal Gel.

    Interpretasi Uji  absah jika kedua replikasi kontrol positif larutan B dan C memberikan hasil positif dan kedua kontrol negatif larutan D adalah negatif. Sediaan uji memenuhi syarat jika diperoleh hasil negatif pada kedua tabung reaksi yang berisi larutan A, dan tidak memenuhi syarat jika diperoleh hasil positif pada dua tabung.

    Ulangi pengujian jika diperoleh hasil positif pada satu tabung reaksi berisi larutan A dan hasil negatif pada tabung lainnya. Sediaan uji memenuhi syarat jika diperoleh hasil negatif pada kedua tabung reaksi pada pengujian ulang. Jika pengujian positif untuk sediaan uji dengan pengenceran lebih kecil dari PMA, pengujian dapat diulang dengan pengenceran tidak melebihi PMA.

Tabel 1 Penyiapan Larutan untuk Uji Penghambatan/Pemacuan Cara Jendal Gel

^a   Larutan A     : larutan sampel dari sediaan uji yang bebas endotoksin

^b   Larutan B    : Uji faktor pengganggu

^c   Larutan C    : Kontrol kepekaan pereaksi LAL sesuai etiket

^d   Larutan D    : Kontrol negatif air pereaksi LAL

Tabel 2. Penyiapan Larutan untuk Pengujian Batas Pembentukan Jendal Gel

*Siapkan larutan A dan kontrol positif produk larutan B dengan pengenceran tidak melebihi  PMA dan lakukan seperti yang tertera pada uji faktor pengganggu teknik pembentukan jendal gel, dalam Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel. Kontrol positif larutan B dan C mengandung endotoksin baku dengan konsentrasi dua kali  kepekaan pereaksi LAL yang tercantum pada etiket. Kontrol negatif, larutan D, adalah Air Pereaksi LAL

Penetapan Kadar Endotoksin Bakteri dengan

Cara Jendal Gel

    Penetapan kadar ini menghitung jumlah endotoksin bakteri dalam larutan sampel dengan cara titrasi hingga titik akhir.

Prosedur Siapkan larutan A,B,C dan D seperti tertera pada Tabel 3 dan uji larutan ini mengikuti prosedur Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, tertera dalam Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel.

Tabel 3 Penyiapan Larutan untuk Penentuan Kadar Pembentukan Jendal Gel

^a Larutan A  : larutan sampel pada pengenceran tidak lebih dari PMA yang pengujian terhadap faktor pengganggu pembentukan jendal gel telah dilakukan. Pengenceran sampel berikutnya tidak lebih dari PMA. Gunakan air pereaksi LAL untuk membuat seri pengenceran dalam empat tabung berisi larutan sampel yang diuji dengan kadar 1, ½, ¼, dan 1/8, relatif terhadap pengenceran yang pengujian terhadap faktor pengganggu telah dilakukan. Pengenceran lainnya dapat digunakan bila sesuai.

^b Larutan B    : Larutan A mengandung endotoksin baku pada kadar 2l (kontrol positif produk)

^c  Larutan C    : Dua seri dari 4 tabung air pereaksi LAL mengandung endotoksin baku dengan kadar berturut-turut 2l, l, 0,5l dan 0,25l.

^d  Larutan D    : Air pereaksi LAL (kontrol negatif).

      Perhitungan dan Interpretasi Uji absah jika kondisi berikut dipenuhi: (1) Kedua replikasi dari kontrol negatif larutan D adalah negatif; (2)Kedua replikasi dari kontrol positif larutan B adalah positif; (3) Rata-rata geometrik kadar titik akhir larutan C berada dalam rentang 0,5l - 2l.

    Untuk menentukan kadar endotoksin dalam larutan A, hitung kadar titik akhir setiap seri replikasi dari pengenceran dengan mengalikan tiap faktor pengenceran titik akhir dengan l. Kadar endotoksin dalam sampel adalah rata-rata geometrik kadar titik akhir replikasi (lihat rumus yang diberikan dalam Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel). Jika pengujian dilakukan dengan mengencerkan larutan sampel, hitung kadar endotoksin dalam sampel awal dengan mengalikannya dengan faktor pengenceran. Jika tidak ada pengenceran sampel yang positif dalam pengujian absah, laporkan kadar endotoksin kurang dari l (jika enceran sampel yang diuji kurang dari l dikalikan faktor pengenceran terkecil dari sampel). Jika semua pengenceran positif, kadar endotoksin dilaporkan sama atau lebih besar dari faktor pengenceran terbesar dikalikan l. (Misalnya: Faktor pengenceran awal 8 kali l pada Tabel 3).

    Bahan memenuhi syarat jika kadar endotoksin kurang dari nilai yang dinyatakan dalam masing-masing monografi.

CARA FOTOMETRIK 

    Metode turbidimetri mengukur peningkatan kekeruhan. Berdasarkan prinsip pengujian yang digunakan, teknik ini diklasifikasikan menjadi turbidimetri titik akhir dan turbidimetri kinetik. Cara turbidimetri titik akhir didasarkan pada hubungan kuantitatif antara kadar endotoksin dan kekeruhan (serapan atau transmisi) dari campuran reaksi pada akhir masa inkubasi. Cara turbidimetri kinetik dapat dilakukan dengan dua cara: mengukur waktu yang dibutuhkan untuk mencapai nilai serapan yang telah ditetapkan atau kecepatan pembentukan kekeruhan.

    Metode kromogenik mengukur kromofor yang dilepaskan dari peptida kromogenik yang sesuai, yang dihasilkan dari reaksi antara endotoksin dengan pereaksi LAL. Berdasarkan prinsip pengujian yang digunakan, teknik ini diklasifikasikan sebagai teknik kromogenik titik akhir atau kromogenik kinetik. Cara kromogenik titik akhir didasarkan pada hubungan kuantitatif antara kadar endotoksin dan pelepasan kromofor pada akhir masa inkubasi. Cara kromogenik kinetik dapat dilakukan dengan mengukur waktu yang dibutuhkan untuk mencapai nilai serapan yang telah ditentukan atau kecepatan pembentukan warna.

    Seluruh pengujian fotometrik dilakukan pada suhu inkubasi yang direkomendasikan oleh produsen Pereaksi LAL, umumnya 37 ± 1°.

Uji Persiapan Cara Fotometrik 

   Untuk menjamin presisi atau keabsahan dari cara turbidimetri dan kromogenik, dilakukan uji persiapan untuk memverifikasi kriteria kurva baku yang absah dan larutan sampel tidak menghambat atau memacu reaksi. Revalidasi metode pengujian diperlukan bila terjadi perubahan  kondisi yang dapat berpengaruh terhadap hasil uji.

    Verifikasi Kriteria Kurva Baku - Dengan menggunakan larutan endotoksin baku, siapkan minimal 3 kadar endotoksin untuk membuat kurva baku. Lakukan pengujian menggunakan minimal 3 replikasi untuk masing-masing kadar endotoksin baku, sesuai instruksi produsen pereaksi LAL (perbandingan  volume, waktu inkubasi, suhu, pH, dan lain-lain). Jika rentang yang diinginkan dalam metode kinetik lebih besar dari 2 log, maka harus dimasukkan larutan baku tambahan, agar  setiap kenaikan log tetap berada dalam rentang kurva baku. Nilai absolut dari koefisien korelasi, ?r?, harus lebih besar atau sama dengan 0,980 untuk rentang kadar endotoksin sebagaimana ditetapkan oleh produsen pereaksi LAL.

    Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Fotometrik Pilih satu kadar endotoksin pada atau di sekitar pertengahan kurva baku endotoksin. Siapkan larutan A, B, C dan D seperti yang tertera pada Tabel 4. Lakukan uji terhadap larutan A, B, C dan D minimal duplo sesuai instruksi untuk Pereaksi LAL yang digunakan (volume sampel dan pereaksi LAL, perbandingan volume sampel dengan pereaksi LAL, waktu inkubasi, dan lain-lain).

    Rata-rata perolehan kembali endotoksin yang ditambahkan adalah kadar endotoksin total dalam larutan  dikurangi kadar endotoksin dalam larutan semula (jika ada). Agar dapat dinyatakan bebas dari faktor pengganggu pada kondisi pengujian, hasil pengukuran kadar endotoksin yang ditambahkan pada  sampel harus berada diantara 50%-200% dari kadar endotoksin yang ditambahkan .

    Bila perolehan kembali endotoksin berada di luar rentang yang ditetapkan maka  faktor pangganggu harus dihilangkan dengan melakukan Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Jendal Gel sebagaimana yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara Jendal Gel. Ulangi Uji Faktor  Pengganggu untuk Cara Jendal Gel untuk memvalidasi perlakuan.

Prosedur Cara Fotometrik 

    Lakukan prosedur seperti yang tertera pada Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Fotometrik  dalam Uji Persiapan Cara Fotometrik.

Perhitungan Untuk Cara Fotometrik 

    Hitung kadar endotoksin dari tiap-tiap replikasi larutan uji A, menggunakan kurva baku yang dibuat dengan kontrol positif larutan C. Uji dinyatakan absahjika kondisi berikut dipenuhi: (1) Hasil kontrol positif larutan C memenuhi persyaratan validasi yang ditetapkan pada Verifikasi Kriteria Kurva Baku dalam Uji Persiapan Cara Fotometrik; (2) Perolehan kembali endotoksin, dihitung dari konsentrasi endotoksin larutan B setelah dikurangi konsentrasi endotoksin larutan A, berada pada rentang 50% – 200%; dan (3) Hasil kontrol negatif larutan D tidak melebihi batas nilai blangko yang dipersyaratkan dalam uraian pereaksi LAL yang digunakan.

Penafsiran Hasil Cara Fotometrik 

    Pada pennetapan kadar secara fotometrik, sediaan uji memenuhi syarat jika rata-rata kadar endotoksin dari replikasi larutan A, setelah koreksi pengenceran dan kadar, lebih kecil dari batas endotoksin produk.

Tabel 4. Penyiapan Larutan untuk Uji Penghambatan/Pemacuan Cara Fotometrik

^a  Larutan A         : Larutan sampel, dapat  diencerkan tidak lebih dari PMA

^b  Larutan B         : Sediaan uji dengan pengenceran yang sama dengan Larutan A mengandung endotoksin yang ditambahkan sehingga kadar yang sama dengan/mendekati kadar tengah  kurva baku.

^c  Larutan C         : Larutan baku Endotoksin baku dengan kadar sebagaimana yang digunakan dalam validasi metode seperti yang tertera pada  Verifikasi Kriteria Kurva Baku dalam Uji Persiapan untuk Cara Fotometrik (seri kontrol positif).

^d  Larutan D          : Air Pereaksi LAL (kontrol negatif).