Vitamin B₁₂

Cyanocobalamin

Vitamin B₁₂ [68-19-9]

C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P                                     BM 1355,37

Sianokobalamin mengandung tidak kurang dari 96,0% dan tidak lebih dari 102.0% C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P, dihitung terhadap zat kering.

Pemerian Hablur atau amorf merah tua atau serbuk hablur merah. Bentuk anhidrat sangat higroskopis. Jika terpapar udara menyerap air lebih kurang 12%.

Kelarutan Agak sukar larut dalam air; larut dalam etanol; tidak larut dalam aseton, dalam kloroform dan dalam eter.

Baku pembanding Sianokobalamin BPFI; tidak boleh dikeringkan. Simpan dalam wadah terlindung cahaya dalam lemari pendingin. Bersifat higroskopis. Buang sisa setelah digunakan.

Identifikasi

    A. Spektrum serapan ultraviolet larutan yang diperoleh pada Penetapan kadar yang diukur pada panjang gelombang 200 nm – 700 nm menunjukkan maksimum pada panjang gelombang lebih kurang 278 nm ± 1 nm, 361 nm ± 1 nm dan 550 nm ± 2 nm. Perbandingan serapan pada panjang gelombang 361 nm dan 278 nm antara 1,70 dan 1,90; dan perbandingan serapan pada panjang gelombang 361 nm dan 550 nm antara 3,15 dan 3,40.

    B. Lebur lebih kurang 1 mg zat dengan lebih kurang 50 mg kalium pirosulfat P dalam krus porselen. Dinginkan, aduk dengan batang pengaduk kaca, tambahkan 3 mL air, didihkan hingga larut. Tambahkan 1 tetes fenolftalein LP dan tambahkan larutan natrium hidroksida P 100 mg per mL, tetes demi tetes sampai merah muda. Tambahkan 500 mg natrium asetat P, 0,5 mL asam asetat 1 N, dan 0,5 mL larutan garam nitroso R 2 mg per mL: segera terjadi warna merah atau merah jingga. Tambahkan 0,5 mL asam hidroklorida P, dan didihkan selama 1 menit: warna merah tetap.

   C. Lakukan penetapan dengan cara  Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Fase gerak dan Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada Cemaran organik.

    Larutan baku Timbang saksama sejumlah Sianokobalamin BPFI, larutkan dan encerkan dengan Fase gerak hingga kadar lebih kurang 50 µg per mL. Gunakan larutan dalam waktu 1 jam.

    Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat, larutkan dan encerkan dengan Fase gerak hingga kadar lebih kurang 50 µg per mL. Gunakan larutan dalam waktu 1 jam.

    Waktu retensi puncak utama Larutan uji sesuai dengan Larutan baku.

Susut pengeringan <1121> Tidak lebih dari 12,0%; lakukan pengeringan dalam hampa udara pada tekanan tidak lebih dari 5 mmHg pada suhu 105º selama 2 jam, menggunakan lebih kurang 25 mg zat.

Cemaran organik Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Larutan A Buat larutan dinatrium hidrogen fosfat P dengan kadar 10 g per Liter.

    Fase gerak Buat campuran metanol P-Larutan A (26,5:73,5), atur pH hingga 3,5 dengan penambahan asam fosfat P. Saring dan awaudarakan. Jika perlu lakukan penyesuaian menurut Kesesuaian sistem seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Larutan kesesuaian sistem Larutkan 25 mg zat dalam 10 mL air, hangatkan jika perlu. Biarkan dingin, tambahkan 5 mL larutan natrium tosilkloramida P 1,0 g per liter dan 0,5 mL asam hidroklorida 0,05 N, encerkan dengan air sampai 25 mL. Kocok, diamkan selama 5 menit. Pipet 1 mL larutan ini, encerkan dengan Fase gerak hingga 10 mL. Suntikkan segera.

    Larutan batas kuantitatif  Timbang sejumlah zat, larutkan dan encerkan dengan Fase gerak hingga kadar 1 µg per mL. Gunakan dalam waktu 1 jam.

    Larutan uji Timbang sejumlah zat larutkan dan encerkan dengan Fase gerak hingga kadar 1 mg per mL. Gunakan dalam  waktu 1 jam.

    Sistem kromatografi Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 361 nm, kolom berukuran 4,6 mm × 25 cm berisi bahan pengisi L7 dengan ukuran partikel 5 µm. Pertahankan suhu kolom pada 35^o. Laju alir lebih kurang 0,8 mL per menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan kesesuaian sistem, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara sianokobalamin dan 7ß,8ß-laktosianokobalamin tidak kurang dari 2,5. Lakukan kromatografi terhadap Larutan batas kuantitatif, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: perbandingan “signal to noise” untuk puncak utama tidak kurang dari 5,0. [Catatan Kromatogram Larutan kesesuaian sistem harus menunjukkan dua puncak utama, sianokobalamin dan 7ß,8ß-laktosianokobalamin. Waktu retensi relatif kedua puncak berturut-turut lebih kurang 1,0 dan 1,2.]

    Prosedur Suntikkan sejumlah volume (lebih kurang 20 µL) Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur semua respons puncak. [Catatan Rekam kromatogram tidak kurang dari tiga kali waktu retensi puncak sianokobalamin.] Hitung persentase masing-masing cemaran dalam zat dengan rumus:

r_i adalah respon puncak masing-masing cemaran dari Larutan uji; r_T adalah jumlah semua respon puncak dari Larutan uji. Masing-masing cemaran dan total cemaran tidak lebih dari batas yang tertera pada Tabel.

Tabel

Catatan Abaikan puncak yang kurang dari 0,1%

Penetapan kadar Lakukan penetapan secara Spektrofotometri seperti yang tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya  <1191>.

    Larutan uji Timbang sejumlah zat,  larutkan dan encerkan dengan air hingga kadar lebih kurang 30 µg per mL.

    Prosedur Ukur serapan Larutan uji pada panjang gelombang serapan maksimum lebih kurang 361 nm, menggunakan air sebagai blangko. Hitung persentase sianokobalamin, C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P, dalam zat yang digunakan dengan rumus:

A_U adalah serapan Larutan uji; A_S adalah serapan jenis  (E^1%) sianokobalamin pada 361 nm dalam 100 mL.g^-1. cm^-1, (207); dan C_U adalah kadar sianokobalamin dalam Larutan uji dalam g per mL berdasarkan bobot yang ditimbang.

Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya. Simpan dalam suhu ruang terkendali.