Baku pembanding Sianokobalamin BPFI; tidak boleh dikeringkan. Lakukan penetapan kadar air secara titrimetri sebelum digunakan. Simpan dalam wadah terlindung cahaya dalam lemari pendingin. Bersifat higroskopis.

    Larutan uji Ukur atau timbang saksama sejumlah zat uji, bila perlu telah diserbukhaluskan, masukkan ke dalam wadah yang sesuai berisi larutan pengekstraksi. Untuk tiap g atau mL zat uji diperlukan 25 mL larutan pengekstraksi yang dibuat segar. Tiap 100 mL pengekstraksi mengandung 1,29 g dinatrium fosfat P, 1,1 g asam sitrat anhidrat P dan 1,0 g natrium metabisulfit P dalam air. Campuran dipanaskan dalam otoklaf pada suhu 121º selama 10 menit. Biarkan partikel yang tidak larut mengendap, saring atau sentrifus jika perlu. Encerkan sejumlah alikot jernih dengan air hingga larutan uji akhir mengandung vitamin B₁₂ dengan aktivitas lebih kurang setara dengan aktivitas Larutan baku sianokobalamin, yang dimasukkan ke dalam tabung penetapan kadar.

    Larutan baku persediaan Timbang saksama sejumlah Sianokabalamin BPFI, larutkan dalam etanol P 25% hingga kadar 1,0 µg per mL. Simpan dalam lemari pendingin.

    Larutan baku Encerkan sejumlah volume Larutan baku persediaan dengan air hingga volume sedemikian rupa hingga setelah masa inkubasi seperti tertera pada Prosedur, perbedaan transmitans antara blangko terinokulasi dan aras 5,0 mL Larutan baku tidak kurang dari yang setara dengan perbedaan 1,25 mg bobot sel kering. Kadar ini biasanya antara 0,01 ng dan 0,04 ng per mL Larutan baku. Buat larutan baku segar untuk setiap penetapan kadar.

    Larutan persediaan media basal Buat media sesuai formula dan cara berikut: Campuran dehidrat yang mengandung komponen sama dapat digunakan dengan syarat ketika dikonstitusi menurut ketentuan yang tercantum pada etiket, memberikan suatu media yang sebanding dengan yang diperoleh dari formula berikut ini. Tambahkan menurut urutan dalam daftar, larutkan secara hati-hati L-sistin P dan L-triptofan P dalam asam hidroklorida P sebelum penambahan delapan larutan berikutnya dalam larutan yang diperoleh. Tambahkan 100 mL air, campur, dan larutkan dekstrosa anhidrat P, natrium asetat P dan asam askorbat P. Saring jika perlu, tambahkan Larutan polisorbat 80, atur pH larutan antara 5,5  dan 6,0 dengan penambahan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air murni hingga 250 mL.

Larutan kasein terhidrolisis asam Buat seperti yang tertera pada Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat <121>.

Larutan asparagin Larutkan 2,0 g L-asparagin P dalam air hingga 200 mL. Simpan di bawah lapisan toluena dalam lemari pendingin.

Larutan adenin-guanin-urasil Buat seperti yang tertera pada Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat <121>.

Larutan xantin Suspensikan 200 mg xantin dalam 30 mL hingga 40 mL air, panaskan hingga suhu lebih kurang 70º, tambahkan 6,0 mL amonium hidroksida 6 N, aduk sampai zat padat melarut. Dinginkan dan tambahkan air hingga 200 mL. Simpan di bawah lapisan toluena dalam lemari pendingin.

Larutan garam A Larutkan 10 g kalium fosfat monobasa P dan 10 g kalium fosfat dibasa P dalam air hingga 200 mL. Tambahkan 2 tetes asam hidroklorida P dan simpan di bawah lapisan toluena.

Larutan garam B Larutkan 4,0 g magnesium sulfat P; 0,20 g natrium klorida P; 0,20 g besi(II) sulfat P dan 0,20 g mangan sulfat P dalam air hingga 200 mL. Tambahkan 2 tetes asam hidroklorida P dan simpan di bawah lapisan toluena.

Larutan polisorbat 80 Larutkan 20 g polisorbat 80 P dalam etanol P hingga 200 mL. Simpan dalam lemari pendingin.

Larutan vitamin I Larutkan 10 mg riboflavin P, 10 mg tiamin hidroklorida P, 100 µg  biotin P dan 20 mg niasin P dalam asam asetat glasial 0,02 N hingga 400 mL. Simpan terlindung dari cahaya dan di bawah lapisan toluena dalam lemari pendingin.

Larutan Vitamin II Larutkan 20 mg asam para-amino benzoat P, 10 mg kalsium pantotenat P, 40 mg piridoksin hidroklorida P, 40 mg piridoksal hidroklorida P, 8 mg piridoksamin dihidroklorida P dan 2 mg asam folat P dalam larutan etanol netral P (1 dalam 4) hingga 400 mL. Simpan terlindung dari cahaya, dalam lemari pendingin.

    Sediaan sari tomat Sentrifus dari tomat dalam kaleng yang dapat diperoleh di perdagangan hingga hampir seluruh daging buah terpisah. Suspensikan bahan penyaring analitik lebih kurang 5 g per liter ke dalam beningan dan saring dengan bantuan pengurangan tekanan melalui lapisan bahan penyaring. Ulangi jika perlu, hingga diperoleh filtrat jernih berwarna jerami. Simpan di bawah lapisan toluena dalam lemari pendingin.

    Media Biakan [Catatan Campuran dehidrat yang mengandung komponen sama dapat digunakan dengan syarat jika dikonstitusi menurut ketentuan yang tercantum pada etiket memberikan suatu media yang sebanding dengan yang diperoleh dari formula berikut ini]. Larutkan 0,75 g ekstrak ragi P larut-air; 0,75 g pepton kering P; 1,0 g dekstrosa anhidrat P dan 0,20 g kalium fosfat monobasa P dalam 60 mL hingga 70 mL air. Tambahkan 10 mL Larutan sari tomat dan 1 mL Larutan polisorbat 80. Atur pH larutan 6,8 dengan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air hingga 100 mL. Masukkan 10 mL larutan dalam tabung reaksi dan tutup dengan kapas, sterilkan tabung dan isinya dalam otoklaf pada suhu 121º selama 15 menit. Dinginkan secepat mungkin untuk menghindarkan pembentukan warna akibat panas berlebih.

Media suspensi Encerkan sejumlah volume Larutan persediaan media basal, dengan air sama banyak. Masukkan 10 mL larutan ke dalam tabung reaksi. Sterilkan dan dinginkan seperti tertera pada Media biakan.

Biakan persediaan Lactobacillus leichmannii Tambahkan 1,0 g hingga 1,5 g agar ke dalam 100 mL Media biakan panaskan diatas tangas uap, sambil diaduk hingga agar melarut. Masukkan lebih kurang 10 mL larutan panas dalam tabung reaksi, tutup dan sterilkan pada suhu 121º selama 15 menit dalam otoklaf (dengan pengatur suhu) dan biarkan tabung dingin dengan posisi tegak. Inokulasi dengan cara tusukan tiga atau lebih tabung dengan biakan murni Lactobacillus leichmannii (sebelum menggunakan pertama kali biakan segar dalam penetapan ini, lakukan pemindahan biakan paling sedikit 10 kali berturut-turut selama 2 minggu). Inkubasi selama 16 - 24 jam pada suhu yang dipilih antara 30º dan 40º, usahakan tetap dalam ± 0,5º dan akhirnya simpan dalam lemari pendingin. Buat biakan segar dalam agar tegak paling sedikit 3 kali tiap minggu dan tidak boleh digunakan untuk pembuatan inokulum jika berumur lebih dari 4 hari. Aktivitas jasad renik dapat ditingkatkan dengan memindahkan biakan tegak tiap hari atau tiap 2 hari, untuk mencapai tingkat dimana ruahan dalam inokulum cair dapat diamati 2 jam sampai 4 jam setelah inokulasi. Biakan yang tumbuh lambat, jarang memberikan kurva respons yang sesuai dan dapat memberikan hasil yang salah.

    Inokulum [Catatan Suspensi beku Lactobacillus leichmannii dapat digunakan sebagai biakan induk, dengan syarat menghasilkan inokulum seperti biakan segar.] Pindahkan sel dari biakan induk Lactobacillus leichmannii, ke dalam 2 tabung steril masing-masing berisi 10 mL media biakan. Inkubasi biakan selama 16 hingga 24 jam pada suhu yang dipilih antara 30º dan 40º; pertahankan suhu tetap dalam ±0,5º. Secara aseptik sentrifus biakan dan enaptuangkan beningan. Suspensikan sel dari biakan dalam 5 mL Media suspensi steril dan campur. Tempatkan volume dengan media suspensi steril sedemikian rupa hingga enceran (1 dalam 20) dalam larutan natrium klorida P 0,9% memberikan transmitrans 70% jika diukur pada panjang gelombang lebih kurang 530 nm menggunakan larutan natrium klorida P 0,9% sebagai blangko. Buat pengenceran (1 dalam 400) suspensi yang telah diukur menggunakan Larutan persediaan media basal dan gunakan untuk inokulum uji (Enceran ini dapat diubah bila perlu hingga diperoleh respons uji yang diinginkan).

Kalibrasi spektrofotometer Tera panjang gelombang spektrofotometer secara berkala, menggunakan sel panjang gelombang baku atau alat yang sesuai. Sebelum membaca setiap pengujian, kalibrasi spektrofotometer untuk transmitans 0% dan 100% menggunakan air dengan panjang gelombang yang diatur pada 530 nm.

Prosedur Bersihkan semua alat secermat mungkin, sebaiknya dilanjutkan dengan pemanasan pada suhu 250º selama 2 jam untuk tabung reaksi kaca tahan panas dengan ukuran lebih kurang 20 mm x 150 mm dan alat kaca lainnya, karena kepekaan yang tinggi dari jasad renik uji terhadap spora bahan pencuci. Tambahkan dalam tiap tabung dari 2 seri tabung reaksi berturut-turut 1,0 mL; 1,5 mL; 2,0 mL; 3,0 mL; 4,0 mL dan 5,0 mL Larutan baku. Pada tiap tabung ini dan 4 tabung kosong yang serupa tambahkan 5,0 mL Larutan persediaan media basal dan air hingga 10 mL. Letakkan 1 seri tabung berisi Larutan baku dan Larutan uji di dalam satu rak dan seri kedua dalam rak lain atau bagian dari rak, sebaiknya letakkan urutan tabung secara acak. Tutup tabung untuk menghindarkan kontaminasi bakteri dan sterilkan dalam otoklaf pada suhu 121º selama 5 menit, bila perlu atur supaya suhu tersebut tercapai tidak lebih dari 10 menit dengan cara memanaskan otoklaf seberlumnya. Dinginkan secepat mungkin untuk menghindarkan pembentukan warna media akibat panas berlebih. Lakukan upaya untuk mempertahankan sterilitas dan pendinginan secara seragam selama penetapan kadar, karena letak tabung yang terlalu berdekatan dalam otoklaf dapat menyebabkan kecepatan pemanasan yang bervariasi.

Secara aseptik tambahkan ke dalam tiap tabung 0,5 mL Inokulum kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi Larutan baku (blangko tidak terinokulasi). Inkubasi tabung pada suhu antara 30º dan 40º pertahankan suhu tetap dalam ± 0,5º selama 16 sampai 24 jam.

Hentikan pertumbuhan dengan cara pemanasan pada suhu tidak kurang dari 80º selama 5 menit. Dinginkan hingga suhu ruang. Goyangkan isinya, dan ukur transmitans dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm. Pengamatan  dilakukan beberapa detik setelah digoyang, bila transmitans tetap selama 30 detik atau lebih. Lakukan pembacaan untuk tiap tabung dalam selang waktu yang hampir sama.

Dengan mengatur transmitans pada 100 untuk blangko tidak terinokulasi, baca transmitans dari blangko terinokulasi. Jika perbedaan lebih besar dari 5% atau jika terkontaminasi dengan jasad renik lain abaikan hasil penetapan.

Dengan mengatur transmitans pada 100% untuk blangko tidak terinokulasi, baca transmitans tiap tabung lain. Abaikan hasil penetapan bila kemiringan kurva baku menunjukkan masalah sensitivitas.

Perhitungan Buat kurva baku antara konsentrasi dan respons dengan cara berikut. Periksa dan abaikan tiap transmitans yang menyimpang. Untuk tiap tingkat kadar baku, hitung respons dari jumlah harga duplikasi transmitans (S) sebagai selisih, y = 2,00 - S. Buat kurva dengan respons pada ordinat kertas grafik terhadap logaritma volume dalam mL dari Larutan baku dalam mL tiap tabung pada absis menggunakan ordinat baik skala aritmetika atau logaritmik, sehingga diperoleh garis mendekati lurus yang lebih baik. Gambar garis lurus atau kurva yang paling mendekati titik yang diperoleh.

Hitung respons y, dengan menambah bersama dua transmitans untuk tiap kadar Larutan uji. Baca dari kurva baku logaritma volume Larutan baku yang sesuai untuk tiap harga y yang terletak dalam rentang titik terendah dan tertinggi dari baku. Kurangkan dari tiap logaritma yang diperoleh dari logaritma volume dalam mL dari Larutan uji untuk memperoleh perbedaan, x, untuk tiap tingkat dosis. Hitung harga rata-rata dari x untuk tiap 3 atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh x = M’, log potensi relatif dari Larutan uji. Hitung jumlah dalam µg, Sianokabalamin BPFI sesuai dengan sianokobalamin dalam sediaan uji dengan persamaan antilog M = antilog (M’ + log R), R adalah jumlah dalam µg sianokobalamin dalam tiap mg (kapsul atau tablet) yang digunakan.

Replikasi Ulangi seluruh penetapan sekurang-kurangnya satu kali menggunakan Larutan uji yang dibuat terpisah. Jika perbedaan antara dua log potensi M tidak lebih dari 0,08, harga rata-rata. M, adalah log potensial sediaan uji, seperti yang tertera pada Penetapan Aktivitas Vitamin B₁₂ dalam Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>. Jika dua penetapan berbeda lebih dari 0,08, lakukan satu atau lebih penetapan tambahan. Dari harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak berbeda lebih dari 0,15 hitung potensi rata-rata Larutan uji