Prosedur berikut ini digunakan untuk menetapkan jumlah residu etilen oksida dan dioksan dalam sediaan yang dibuat dari etilen oksida. Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, gunakan Metode I.

Metode I

[Peringatan Etilen oksida adalah zat toksik dan mudah terbakar. Siapkan larutan ini dengan hati-hati di dalam lemari asam berventilasi baik. Lindungi tangan dan wajah dengan memakai sarung tangan polietilen dan masker yang sesuai. Simpan semua larutan dalam wadah kedap udara, pada suhu antara 4°  sampai 8°].

[Catatan Sebelum menggunakan polietilen glikol 200 P pada pengujian ini, hilangkan semua komponen mudah menguap dengan menempatkan 500 mL polietilen glikol 200 P dalam labu alas bulat 1000 mL dan sambungkan labu dengan penguap berputar, pertahankan pada suhu 60° dan vakum 10-20 mmHg selama 6 jam].

    Larutan Asetaldehida Asetaldehida P 10 mg per mL [Catatan Siapkan segera sebelum digunakan].

    Larutan etilen oksida persediaan Buat larutan etilen dioksida 2,5 mg per g yang disiapkan dengan cara sebagai berikut: Tara Erlenmeyer bersumbat kaca, tambahkan 50 mL polietilen glikol 200 P, dan timbang kembali Erlenmeyer. Masukkan 5 mL etilen oksida P cair dalam gelas piala 100 mL dinginkan dalam campuran natrium klorida P dan es (1:3). Masukkan 300 ml (250 mg) etilen oksida cair P pada polietilen glikol 200 P, aduk perlahan-lahan sampai tercampur. Sumbat Erlenmeyer, timbang kembali labu dan tetapkan jumlah etilen dioksida yang diabsorbsi dengan adanya perbedaan berat. Atur berat campuran dengan menambahkan polietilen glikol 200 P sampai 100,0 g, sumbat Erlenmeyer dan goyang hati-hati sampai tercampur. [Catatan Isi botol pendingin bertekanan dengan etilen oksida cair dan simpan dalam lemari pembeku bila tidak digunakan. Gunakan sepotong kecil film polietilen untuk melindungi cairan dari kontak dengan karet penutup. Gunakan peralatan yang telah didinginkan bila diperlukan. Buat larutan persediaan segera sebelum digunakan, dan simpan dalam lemari pendingin].

    Larutan etilen oksida Tara Erlenmeyer bersumbat kaca dan dinginkan dalam lemari pendingin. Tambahkan 35 mL polietilen glikol 200 P, dan timbang kembali labu. Masukkan 1 g Larutan persediaan etilen dioksida dingin ke dalam Erlenmeyer bersumbat. Atur berat campuran dengan menambahkan polietilen glikol 200 P sampai 50,0 g, sumbat kembali, goyang hati-hati sampai tercampur. Pindahkan 10 g larutan ini pada labu tentukur 50-mL. Tambahkan 30 mL air dan campur. Encerkan dengan air sampai tanda, dan campuran yang diperoleh mengandung etilen oksida lebih kurang 10 mg per mL. [Catatan Gunakan peralatan yang telah didinginkan jika diperlukan. Buat segera sebelum digunakan].

    Larutan dioksan 500 mg per mL dioksan P.

    Larutan Baku A Masukkan 0,1 mL Larutan etilen oksida ke dalam vial “headspace” bertekanan 10-mL. [Catatan Vial berukuran lain misalnya vial “headspace”  bertekanan 22-mL dapat digunakan, tergantung kondisi operasional. Akan tetapi harus digunakan “headspace” berukuran sama untuk Larutan baku A, Larutan baku B dan Larutan uji]. Tambahkan 0,1 mL Larutan Asetaldehida dan 0,1 mL Larutan dioksan, tutup vial.

    Larutan Baku B Timbang 1,0 g zat uji, masukkan ke dalam vial “headspace” bertekanan 10-mL dan tambahkan 0,1 mL Larutan etilen oksida; 0,1 mL Larutan dioksan dan 1,0 mL N,N-dimetilasetamida P, tutup vial.

    Larutan uji Timbang 1,0 g zat uji masukkan ke dalam vial “headspace” bertekanan 10-mL dan tambahkan 1,0 mL N,N-dimetilasetamida P dan 0,2 mL air. Tutup vial dan campur.

    Sistem kromatografi  Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf gas “headspace” dilengkapi detektor ionisasi nyala dan kolom kapiler terbuat dari kaca atau kuarsa 0,32 mm x 30 m, berisi bahan pengisi fase G1 dengan tebal lapisan 1,0 mm. Gas pembawa gas helium P dipertahankan pada kecepatan linier 20 cm per detik. Suhu injektor dan detektor dipertahankan berturut-turut pada suhu 150° dan 250°. Suhu kolom diprogram sebagai berikut:

Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku A, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara aseltadehida dan etilen oksida tidak kurang dari 2,0; perbandingan “signal to noise” tidak kurang dari 5,0 ditetapkan dari puncak dioksan; simpangan baku relatif  pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 15,0%. [Catatan Waktu retensi relatif asetaldehida dan etilen oksida berturut-turut adalah 0,94 dan 1,0].

    Sistem “headspace sampler” Atur suhu “transfer line” 150°, suhu pengaturan tekanan 1 menit dan waktu injeksi 12 detik.  Waktu untuk kesetimbangan suhu selama 45 menit dan suhu kesetimbangan masing-masing: 70° untuk Larutan baku A,  90° untuk Larutan baku B dan 90° untuk Larutan uji.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 1 mL “headspace” gas dengan “split ratio” 20:1) Larutan baku B dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. [Catatan Waktu retensi relatif untuk etilen oksida dan dioksan berturut-turut adalah 1,0 dan 2,5]. Hitung jumlah etilen dioksida dalam bpj, dalam zat yang digunakan dengan rumus:

A_E adalah jumlah etilen oksida dalam mg yang ditambahkan dalam Larutan baku B; r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak etilen oksida dari Larutan uji dan Larutan baku B;  W_U adalah bobot zat dalam g yang digunakan untuk membuat Larutan uji; Ws adalah bobot dalam g yang digunakan untuk membuat Larutan baku B. Hitung jumlah dioksan dalam bpj, dalam zat yang digunakan dengan rumus:

A_D  adalah jumlah dioksan dalam mg yang ditambahkan dalam Larutan baku B; r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak dioksan dari Larutan uji dan Larutan baku B; W_U adalah bobot zat dalam g yang digunakan untuk membuat Larutan uji; W_S adalah bobot zat dalam g yang digunakan untuk membuat Larutan baku B.

Metode II

    Larutan baku etilen dioksida Encerkan 0,5 mL etilen oksida P dalam metilen klorida P (50 mg per mL) dengan air sampai 50,0 mL. [Catatan Larutan stabil selama 3 bulan jika disimpan dalam vial politetrafluoroetilen (politef)-dengan tutup berlapis membran silikon pada suhu -20°]. Biarkan sampai mencapai suhu ruang. Encerkan 1,0 mL larutan dengan air sampai 250,0 mL hingga diperoleh larutan dengan kadar etilen dioksida 2 mg per mL. [Catatan Buat segera sebelum digunakan].

    Larutan baku dioksan 0,05 ml per mL dioksan.

    Larutan baku aseltadehida Larutan mengandung asetaldehida 10 mg per mL [Catatan Buat segera sebelum digunakan].

    Larutan Resolusi Pipet 2 mL Larutan baku asetaldehida dan 2 mL Larutan baku etilen oksida ke dalam vial “headspace” 10-mL. Segera tutup vial dengan membran silikon berlapis politef dan perkuat dengan tutup luar aluminium, campur hati-hati.

    Larutan baku A  Buat larutan etilen oksida dengan kadar 0,48 mg per mL dari Larutan baku etilen oksida dan dioksan dengan kadar 0,005 mg per µl dari Larutan baku dioksan.

    Larutan baku B  Timbang 1,0 g zat, masukkan ke dalam vial “headspace” 10-mL. Tambahkan 2,0 mL Larutan  baku A. Segera tutup vial dengan membran silikon berlapis politef dan perkuat dengan tutup luar aluminium campur hati-hati.

    Larutan uji Timbang 1,0 g zat, masukkan ke dalam vial “headspace” 10-mL. Tambahkan 2,0 mL air. Segera tutup vial dengan membran silikon berlapis politef dan perkuat dengan tutup luar aluminium campur hati-hati.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf gas “headspace” dilengkapi detektor ionisasi nyala dan kolom kapiler terbuat dari leburan silika 0,53 mm x 50 m, berisi bahan pengisi fase G27 dengan tebal lapisan 5,0 mm. Gas pembawa helium P dipertahankan pada laju alir 4 mm per menit. Sistem “headspace sampler” waktu untuk kesetimbangan suhu selama 30 menit dan suhu kesetimbangan 80°. Suhu injektor dan detektor dipertahankan berturut-turut pada suhu 85° dan 250°. Suhu kolom diprogram sebagai berikut: suhu awal dipertahankan pada 70º selama 10 menit, kemudian diatur kecepatan kenaikan suhu lebih kurang 10º per menit sampai 250º dan pertahankan suhu tersebut selama 5 menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan resolusi, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara asetaldehida dan etilen oksida tidak kurang dari 2,0 [Catatan Waktu retensi relatif asetaldehida dan etilen oksida berturut-turut adalah 0,9 dan 1,0].

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 1 mL “headspace” gas dengan “split ratio” 3,5:1) Larutan baku B dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. [Catatan Waktu retensi relatif untuk etilen oksida dan dioksan berturut-turut adalah 1,0 dan 1,9]. Hitung jumlah etilen dioksida dalam bpj, dalam zat yang digunakan dengan rumus:

C_E adalah kadar etilen oksida dalam mg per mL Larutan baku A; V adalah volume Larutan baku A yang ditambahkan pada Larutan baku B (2,0 mL); r_U  dan r_S berturut-turut adalah respons puncak etilen oksida Larutan uji dan Larutan baku B; W_U adalah bobot dalam g zat yang digunakan untuk membuat Larutan uji; W_S adalah bobot dalam g zat yang digunakan untuk membuat Larutan baku B.

Hitung jumlah dioksan dalam bpj, dalam zat yang digunakan dengan rumus:

C_D adalah kadar dioksan dalam ml per mL Larutan baku A; V adalah volume Larutan baku A yang ditambahkan pada Larutan baku B (2,0 mL); r adalah bobot jenis dioksan (1,03 g per mL = 1,03 mg per ml); F adalah faktor konversi (1000 mg per mg); r_U respons puncak dioksan dari Larutan uji; r_S adalah respons puncak etilen oksida dari Larutan baku B; W_U adalah bobot zat dalam g yang digunakan untuk membuat Larutan uji dan W_S adalah bobot zat dalam g yang digunakan untuk membuat Larutan baku B.