Pendahuluan dan Informasi Umum

    Aktivitas (potensi) antibiotik dapat dilihat dari efek inhibitor terhadap mikroba dengan kondisi yang sesuai. Penurunan aktivitas antimikroba kadang-kadang tidak dapat ditunjukkan dengan metode kimia. Bab ini mencakup cara kerja penetapan antibiotik yang tercantum dalam Farmakope ini, yang menggunakan penetapan secara mikrobiologi sebagai metode analisis standar.

    Ada dua metode umum yang digunakan yaitu penetapan cara lempeng-silinder (lempeng) dan turbidimetri (tabung). Tabel 1 memuat daftar antibiotik yang potensinya dapat ditetapkan secara mikrobiologi dan cara penetapannya.

Tabel 1

[Catatan Lakukan semua prosedur dengan kondisi yang dirancang untuk mencegah kontaminasi mikroba dari luar. Selama melaksanakan pengujian, lakukan tindakan pengamanan untuk kemungkinan alergi terhadap obat dan mikroba hidup yang digunakan dalam prosedur].

    Penetapan cara lempeng: Penetapan cara dalam silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan Petri atau lempeng, sehingga pertumbuhan mikroba spesifik yang diinokulasikan dihambat pada daerah disekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik berupa lingkaran atau “zona”.

    Penetapan cara tabung: Penetapan cara tabung berdasarkan pada penghambatan pertumbuhan mikroba dalam larutan serba sama, baik dengan antibiotik dan tanpa antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat.

    Unit dan Baku Pembanding: Pada umumnya potensi setiap antibiotik ditunjukkan dengan satuan unit atau µg aktivitas. Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI) dikalibrasi terhadap baku primer antibiotik yang sesuai. Antibiotik BPFI dibuat dan diedarkan oleh instansi yang berwenang.

    Pengertian mg aktivitas berasal dari sediaan antibiotik yang dipilih sebagai baku pembanding yang dianggap secara keseluruhan terdiri dari bahan kimia tunggal, dan oleh karena itu dinyatakan potensi 1000 mg per mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metode pembuatan dan pemurnian antibiotik tertentu, aktivitas sediaan dapat lebih dari 1000 mg per mg. Karenanya dapat dimengerti bahwa sediaan yang demikian mempunyai aktivitas yang setara dengan jumlah tertentu mg baku pembanding asli. Tetapi pada umumnya mg aktivitas adalah tepat setara secara numerik  dengan mg (bobot) sediaan murni. Kesulitan timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotik terdiri dari bentuk basa bebas dan garamnya, dan mg aktivitas dinyatakan untuk salah satu dari bentuk tersebut; bahan antibiotik terdiri dari sejumlah komponen yang mempunyai sifat kimia yang sangat mirip tetapi mempunyai aktivitas antibiotik yang berbeda; atau potensi dari satu golongan antibiotik dinyatakan dengan baku pembanding yang merupakan salah satu dari anggota antibiotik, tetapi sediaan itu sendiri dapat tidak serba sama (heterogen). Dalam hal ini mg aktivitas/ unit harus dianggap tidak sama dengan mg (bobot) dari bahan antibiotik.

    Peralatan: Semua peralatan harus dicuci bersih sebelum dan sesudah digunakan seperti tertera pada Pencucian Peralatan Kaca <1331>. Peralatan gelas untuk menyimpan dan memindahkan mikroba uji, disterilkan dengan pemanasan kering, uap air, radiasi, atau peralatan steril sekali pakai.

    Pengendalian Suhu: Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa tahap penetapan secara mikrobiologi pada pembiakan mikroba dan penyiapan inokulanya, selama inkubasi pada penetapan secara lempeng dan tabung mengacu persyaratan suhu spesifik seperti tertera pada masing-masing cara penetapan.

    Mikroba uji: Mikroba uji untuk masing-masing antibiotik tertera pada Tabel 3 untuk penetapan cara lempeng dan Tabel 8 untuk cara tabung. Mikroba uji spesifik ini dengan nomor identitas dari American Type Culture Collection (ATCC).

    Untuk memastikan dapat diterima sebagai mikroba uji maka penyimpanan dan pemeliharaan harus benar. Tetapkan kondisi penyimpanan spesifik selama validasi atau verifikasi metode. Musnahkan biakan bila terlihat ada perubahan karakteristik  mikroba uji.

    Penyimpanan Jangka Panjang: Untuk penyimpanan jangka panjang, pemeliharaan mikroba uji dapat disimpan dalam larutan yang sesuai seperti calf serum 50%, gliserol 10%-15% dalam Trypic Soy Broth, darah domba bebas fibrin, atau susu skim. Penyimpanan biakan jangka panjang yang terbaik dalam bentuk beku kering; pada suhu -60° atau dibawahnya; dan suhu dibawah -20^o masih dapat diterima.

    Kultur Primer: Siapkan kultur primer dengan memindahkan mikroba uji dari vial penyimpanan jangka panjang ke media yang sesuai dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Simpan kultur primer pada suhu 2°-8° dan musnahkan setelah tiga minggu. Satu tabung kultur primer dapat digunakan untuk kultur kerja paling lama tujuh hari.

    Kultur Kerja: Siapkan kultur kerja dengan memindahkan kultur primer ke permukaan lempeng media padat untuk memperoleh koloni yang terpisah. Untuk menyiapkan inokula uji, inkubasi kultur kerja pada suhu yang sesuai hingga diperoleh pertumbuhan yang baik. Siapkan kultur kerja segar untuk tiap kali pengujian.

    Pertumbuhan atau kinerja yang tidak spesifik dari mikroba uji: Bila mikroba uji  menunjukkan pertumbuhan atau kinerja yang tidak spesifik, gunakan kultur stok atau kultur primer atau kultur kerja baru.

    Rancangan penetapan: Rancangan percobaan yang sesuai adalah hal penting untuk meningkatkan presisi dan memperkecil bias. Pengendalian terhadap parameter inkubasi, distribusi suhu dan waktu merupakan faktor kritis untuk memperkecil bias; hal ini dapat diatasi dengan penyusunan lempeng  atau rak seperti diuraikan pada setiap penetapan.

    Penetapan cara lempeng: Perbandingan dibatasi hanya untuk hubungan pengukuran diameter zona antar lempeng dengan mengabaikan variasi antar lempeng. Respons tiap lempeng dikoreksi berdasarkan ukuran zona relatif dari baku terhadap rata-rata ukuran zona dari baku pada semua lempeng.

    Penetapan cara tabung: Untuk menghindari bias sistematis, tempatkan tabung replika secara acak pada rak yang terpisah sehingga masing-masing rak terdiri dari  satu set perlakuan. Tujuan penyusunan ini adalah untuk meminimalkan pengaruh distribusi suhu pada sampel. Pada penetapan cara tabung, susunan sampel pada rak tabung pengujian, sensitif terhadap perubahan variasi suhu. Pengaruh variasi suhu juga dapat dikurangi dengan memastikan kecukupan aliran udara atau perpindahan panas selama inkubasi. Sedikitnya tiga tabung dari sampel dan dosis baku (satu set lengkap sampel) harus disusun pada satu rak. Perbandingan dibatasi untuk kekeruhan biakan dalam tabung pada satu rak.

    Pertimbangan Penetapan Potensi: Dengan adanya hambatan diatas, rancangan penetapan menggunakan lima tingkat dosis baku dan satu tingkat dosis sampel untuk masing-masing larutan sampel.

    Untuk penetapan cara lempeng, tiap lempeng hanya dua perlakuan, yaitu perlakuan untuk baku (dosis tengah; S₃) dan perlakuan salah satu dari empat tingkat dosis baku (S₁,S_2,S_4, dan S₅) atau sampel (U₃). Dosis sampel sebagai dasar perkiraan dosis target. Sampel harus diencerkan untuk menghasilkan nilai dosis terukur yang diperkirakan setara dengan dosis tengah baku (S₃). Tujuan pengenceran dosis tengah baku adalah untuk memastikan bahwa hasil sampel terletak dalam kurva baku. Pengujian ini menetapkan potensi relatif U₃ terhadap kurva baku. Sampel (U₃) harus mempunyai potensi relatif lebih kurang 100%. Potensi akhir dari sampel diperoleh dengan mengalikan hasil U₃ dengan faktor pengenceran.

    Suatu penetapan dipandang sebagai penetapan pendahuluan jika potensi yang dihitung kurang dari 80% atau lebih dari 125% dari yang diperkirakan pada penyiapan larutan uji persediaan. Hal ini menunjukkan bahwa dosis sampel yang diperkirakan pada waktu penyiapan larutan persediaan tidak tepat. Dalam hal ini, tentukan potensi perkiraan yang sesuai dan ulangi penetapan. Selain itu, potensi juga dapat diperoleh dari bagian kurva dimana respons baku dan sampel tidak paralel.

    Penetapan potensi secara mikrobiologi dipengaruhi oleh variabel antar-penetapan dan intra-penetapan, sehingga diperlukan dua atau lebih penetapan yang berdiri sendiri untuk perkiraan potensi yang dapat dipercaya dari penetapan sediaan tertentu atau sediaan uji. Penetapan diawali dengan pembuatan terpisah larutan persediaan dan pengenceran baik baku maupun sediaan uji, ulangi penetapan sediaan uji pada hari yang berbeda. Potensi rata-rata harus meliputi semua hasil penetapan berdiri sendiri yang valid. Jumlah penetapan yang diperlukan untuk mencapai hasil potensi perkiraan yang dapat dipercaya tergantung pada variabilitas penetapan dan persyaratan maksimum  ketidakpastian pengukuran potensi perkiraan. Ketidakpastian pengukuran dapat dilihat dari lebarnya rentang kepercayaan seperti tertera pada Batas Kepercayaan dan Kombinasi Perhitungan Penetapan dalam Perhitungan. Gabungan hasil suatu seri kecil penetapan yang berdiri sendiri dalam sebaran beberapa hari merupakan perkiraan potensi yang lebih dipercaya daripada satu penetapan yang besar dengan jumlah keseluruhan lempeng atau tabung yang sama. Perlu diperhatikan bahwa penetapan tambahan atau variabilitas yang lebih rendah menjadikan produk dapat memenuhi kisaran spesifikasi yang lebih ketat. Pengurangan variabilitas penetapan dapat mencapai batas kepercayaan yang diperlukan dengan jumlah penetapan yang lebih sedikit.  

Metode Lempeng-Silinder

    Pengendalian suhu: Gunakan peralatan yang terkualifikasi dan terkalibrasi untuk memperoleh rentang suhu seperti tertera pada Tabel 3.

Peralatan

    Lempeng: Cawan Petri kaca atau plastik sekali pakai (berukuran 20x100 mm atau ukuran lain yang sesuai) dengan penutup.

    Silinder: Silinder besi tahan karat atau porselen; diameter luar 8 ± 0,1 mm; diameter dalam 6 ± 0,1 mm; tinggi 10 ± 0,1 mm. [Catatan Cuci silinder dengan saksama untuk membersihkan semua residu, kadang-kadang diperlukan suatu asam seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat seperti yang tertera pada Pencucian Peralatan Kaca <1331>].

    Larutan baku: Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah baku pembanding yang sesuai dengan antibiotik seperti tertera pada Tabel 2; dan encerkan hingga dosis yang ditentukan. Simpan pada suhu 2°-8°, dan gunakan dalam waktu yang disarankan. Pada hari penetapan, siapkan pengenceran dari larutan persediaan 5 atau lebih larutan untuk pengujian dengan dosis bertahap, umumnya dengan perbandingan 1:1,25. Gunakan pengencer akhir yang dinyatakan dan urutan dosis dengan dosis tengah seperti tertera pada Tabel 2.

    Larutan sampel: Tentukan perkiraan potensi per bobot atau volume sampel. Pada hari penetapan, siapkan larutan persediaan serta enceran larutan sampel setiap antibiotik dengan pengencer akhir yang sama seperti untuk baku pembanding seperti tertera pada Tabel 2. Encerkan larutan persediaan sampel dengan pengencer akhir untuk mendapatkan dosis setara dengan dosis tengah larutan baku (S₃).

    Inokula: Suspensikan mikroba uji dari biakan segar agar miring atau biakan lain dalam 3 mL salin LP steril. Butiran kaca dapat digunakan untuk memudahkan pembuatan suspensi. Sebarkan suspensi ke permukaan lapisan dari dua atau lebih lempeng agar atau permukaan media agar dalam botol Roux (menutupi seluruh permukaan) yang berisi 250 mL media seperti tertera pada Tabel 3.

    Inkubasi selama waktu dan suhu tertentu seperti tertera pada Tabel 3, atau hingga pertumbuhan terlihat jelas.

    Setelah inkubasi, mikroba uji dipanen dari biakan lempeng agar atau botol Roux dengan lebih kurang 50 mL salin LP steril menggunakan batang kaca bengkok steril atau butiran kaca steril, kecuali untuk bleomycin menggunakan Medium 34 seperti tertera pada Media dan Larutan. Suspensi dipipet ke dalam wadah kaca steril, dan disebut suspensi persediaan.

    Encerkan sejumlah suspensi persediaan dengan salin LP steril, ukur transmitan pada panjang gelombang 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-Visibel. Target nilai transmitan lebih kurang 25% pada panjang gelombang 580 nm. Nilai ini digunakan untuk membakukan volume suspensi persediaan yang ditambahkan ke dalam lapisan agar inokula.

    Dimulai dengan volume yang tertera pada Tabel 3, penentuan proporsi dari suspensi persediaan yang ditambahkan ke dalam media inokula yang menghasilkan diameter zona hambatan yang memuaskan lebih kurang 14-16 mm pada dosis tengah baku (S₃) dilakukan selama verifikasi metode. [Catatan Ukuran zona diluar kisaran 11-19 mm tidak diinginkan, karena dapat menambah variabilitas penetapan.] Jika transmitan pengenceran diatas 25%, untuk menormalkannya dengan meningkatkan perbandingan mikroba uji pada lapisan inokula. Faktor normalisasi ditentukan dengan membagi transmitan yang diperoleh dari pengenceran dengan 25. Perbandingan ini kemudian dikalikan dengan jumlah inokula yang disarankan untuk memperoleh volume (mL) dari suspensi persediaan yang dibutuhkan untuk ditambahkan ke dalam lapisan inokula. Jika diperlukan, sesuaikan jumlah inokula berdasarkan perhitungan harian untuk memperoleh hubungan dosis–respons yang optimum.

    Cara lain, selama verifikasi metode tentukan bagian suspensi persediaan yang akan dimasukkan sebagai inokula, dimulai dengan volume seperti yang tertera dalam Tabel 3, yang hasilnya memenuhi batas zona hambatan dengan diameter 14-16 mm pada dosis tengah baku (S₃), dan memberikan suatu hubungan dosis – respons yang reprodusibel. Siapkan inokula dengan menambahkan sejumlah suspensi persediaan ke dalam media agar yang telah dicairkan dan didinginkan hingga suhu 45° sampai 50°, putar campuran tanpa menimbulkan gelembung hingga diperoleh suspensi homogen.

    Analisis: Siapkan lapisan dasar untuk sejumlah cawan Petri penetapan, gunakan media dan volume seperti tertera pada Tabel 4.

Tabel 2

^a       Dapat diterima untuk menyesuaikan dengan dosis tengah untuk optimasi ukuran zona jika data yang ada tetap dalam rentang linier.

^b     µg dalam kolom ini menyatakan µg aktivitas.

^c     Siapkan larutan baku dan larutan uji secara bersamaan.

^d     Pengenceran larutan persediaan selanjutnya dengan dimetil sulfoksida untuk menghasilkan dosis 12,8; 16; 20; 25; dan 31,2 µg/mL sebelum membuat larutan uji. Larutan uji harus berisi dimetil sulfoksida sejumlah yang sama dengan larutan baku.

^e     Huruf D menyatakan Dapar seperti tertera pada Media dan Larutan, Dapar untuk menjelaskan setiap Dapar dalam tabel ini.

^f     Setiap larutan baku harus berisi asam hidroklorida sejumlah sama dengan larutan uji.

^g     Penetapan cara tabung dapat digunakan sebagai prosedur pilihan lain.

^h     Encerkan larutan persediaan  lebih lanjut dengan dimetil formamida untuk menghasilkan dosis 256; 320; 400; 500; dan 624 U/mL sebelum membuat larutan uji. Siapkan larutan baku bersamaan dengan larutan uji. Larutan uji harus berisi dimetil formamida sejumlah sama dengan larutan baku. Gunakan peralatan kaca aktinik rendah.

ⁱ     Siapkan larutan persediaan dengan menambahkan 2 mL air untuk setiap 5 mg baku pembanding.

Tabel 3

^a        American Type Culture Collection

^b        Seperti tertera pada Media dan Larutan, Media

^c    Gunakan 0,5 mL enceran suspensi persediaan 1 : 25 pada setiap 100 mL Media 10

Tabel 4 (lapisan dasar)

^a        Seperti tertera pada Media dan Larutan, Media

^b     Tidak digunakan lapisan dasar

[Catatan Lapisan dasar boleh dihangatkan untuk membantu lapisan inokula yang seragam]

Tabel 5 (lapisan inokula)

^a        Seperti tertera pada Media dan Larutan, Media

Tabel 6

    Biarkan media memadat membentuk lapisan dasar rata dengan ketebalan seragam. Siapkan sejumlah inokula sesuai lapisan inokula pada Tabel 5 sesuai dengan antibiotik seperti yang tertera pada Tabel 3 dengan memperhitungkan berdasarkan pada uji pendahuluan. Putar lempeng ke depan-belakang untuk menyebarkan inokula di atas permukaan lapisan dasar, dan kemudian biarkan memadat.

    Jatuhkan  6 buah  silinder pada permukaan yang telah diinokulasi dari ketinggian 12 mm, menggunakan alat mekanik atau alat lain untuk menjamin penempatannya pada radius 2,8 cm, kemudian tutup cawan untuk mencegah kontaminasi.  Isikan keenam silinder pada tiap lempeng dengan enceran antibiotik dengan tingkat dosis (S₁ – S₅ dan U₃) seperti yang tertera dalam bab berikut. Inkubasi lempeng seperti tertera pada Tabel 6 selama 16-18 jam, kemudian seluruh silinder dikeluarkan dari lempeng. Ukur dan catat diameter antar zona hambatan pertumbuhan mendekati 0,1 mm.

    Baku (S₁–S₅) dan tingkat dosis tunggal sampel U₃ yang sesuai dengan S₃ kurva baku seperti tertera pada Penyiapan Baku dan Penyiapan Sampel Uji yang akan digunakan untuk penetapan. Untuk memperoleh kurva baku, isi silinder selang-seling pada tiap tiga cawan dengan dosis tengah baku (S₃) dan tiap silinder dari sembilan silinder sisanya dengan satu dari empat pengenceran larutan baku. Lakukan hal yang sama untuk tiga pengenceran baku lainnya. Untuk sampel, isi silinder selang-seling pada tiap tiga cawan dengan dosis tengah baku (S₃) dan sembilan silinder sisa dengan enceran larutan sampel yang sebanding (U₃).

Metode Tabung

    Pengendalian suhu: Gunakan peralatan yang memenuhi syarat terkualifikasi dan terkalibrasi untuk mendapatkan rentang suhu seperti tertera pada Tabel 8. [Catatan Pengendalian suhu dapat dicapai menggunakan sirkulasi udara atau air. Kapasitas pemanasan dari air lebih besar dan lebih menguntungkan daripada sirkulasi udara].

    Spektrofotometer: Pengukuran serapan atau transmitan dalam pita frekuensi yang sempit, membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai sumber cahaya panjang gelombang yang dapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 580 nm atau dengan 530 nm. Kemungkinan lain dapat digunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang bervariasi dan diatur 580 nm atau 530 nm.

Alat dapat diatur hingga dapat menerima tabung yang digunakan untuk inkubasi  (seperti tertera pada Peralatan di bawah ini) dan menggunakan sel yang dimodifikasi yang dilengkapi dengan pipa pembuangan untuk memudahkan pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang mempunyai saluran untuk pengaliran secara sinambung selama pengukuran.

    Atur serapan dengan blangko untuk serapan nol menggunakan media cair yang jernih tanpa inokula yang disiapkan seperti dinyatakan untuk masing-masing antibiotik, termasuk sejumlah yang sama larutan uji dan formaldehida seperti yang terdapat dalam tiap sampel. Baik serapan atau transmitan dapat diukur ketika menyiapkan inokula.

    Peralatan: Tabung reaksi kaca atau plastik ukuran 16 x 125 mm atau 18 x 150 mm. [Catatan   Gunakan tabung dengan panjang, diameter dan ketebalannya relatif seragam serta permukaannya tidak cacat dan tidak tergores. Tabung yang akan ditempatkan pada spektrofotometer harus yang sesuai, tanpa goresan dan tidak cacat. Bersihkan tabung dari semua residu antibiotik dan sisa larutan pembersih, dan sterilkan sebelum digunakan  untuk penetapan berikutnya.]

    Larutan baku: Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah baku pembanding antibiotik yang sesuai atau seluruh isi satu vial jika diperlukan dalam pelarut seperti tertera pada Tabel 7; dan encerkan hingga dosis yang dikehendaki. Simpan pada suhu 2^o-8^o, dan gunakan dalam waktu yang ditentukan. Pada hari penetapan, siapkan dari larutan persediaan sebanyak lima atau lebih larutan uji, dengan peningkatan dosis berturut-turut, umumnya dalam perbandingan 1:1,25. [Catatan Untuk penetapan cara tabung, pengenceran larutan persediaan dapat dibuat dalam perbandingan lebih kecil.] Gunakan pengencer akhir sehingga diperoleh dosis tengah baku (S₃) seperti tertera pada Tabel 7.

    Larutan sampel: Tentukan perkiraan potensi per bobot atau volume sampel. Pada hari penetapan, siapkan larutan persediaan serta enceran larutan uji dengan pengencer akhir yang sama seperti untuk baku pembanding (Tabel 7). Encerkan larutan persediaan sampel dengan pengencer akhir untuk mendapatkan dosis setara dengan dosis tengah baku dari larutan baku (S₃) seperti tertera pada Tabel 7.

    Inokula: Suspensikan mikroba uji dari pertumbuhan biakan segar agar miring atau dalam 3 mL salin LP steril. Butiran kaca dapat digunakan untuk memudahkan pembuatan suspensi. Enterococcus hirae (ATCC 10541) dan Staphylococcus aureus (ATCC 9144) dibiakkan dalam media cair tidak pada agar. Sebarkan suspensi ke permukaan lapisan dari dua atau lebih lempeng agar atau ke permukaan media agar dalam botol Roux (menutupi seluruh permukaan) yang berisi 250 mL media seperti tertera pada Tabel 8. Inkubasi selama waktu dan suhu tertentu seperti tertera pada Tabel 8, atau hingga pertumbuhan terlihat jelas.

    Setelah inkubasi, mikroba uji dipanen dari biakan lempeng agar atau botol Roux dengan lebih kurang 50 mL salin LP steril menggunakan batang kaca bengkok steril atau butiran kaca steril. Pipet suspensi kedalam wadah kaca steril, dan disebut suspensi persediaan.

    Selama verifikasi metode, tentukan sejumlah suspensi persediaan yang akan dimasukkan sebagai inokula, dimulai dengan volume yang disarankan dalam Tabel 8. Siapkan juga larutan S₃ tambahan sebagai uji pertumbuhan dan inkubasi pada suhu yang tertera pada Tabel 11. Jika perlu, atur jumlah inokula setiap hari untuk memperoleh hubungan dosis-respons optimum dari pertumbuhan mikroba uji dalam penetapan cara tabung. Setelah selesai inkubasi, tabung yang berisi larutan baku dosis tengah seharusnya mempunyai nilai serapan seperti tertera pada Tabel 9. Tentukan lamanya inkubasi dengan mengamati pertumbuhan berdasarkan dosis tengah larutan baku (S₃).

    Analisis: Pada hari penetapan siapkan dosis antibiotik seperlunya dengan mengencerkan larutan baku persediaan dan sampel seperti yang ditetapkan pada Larutan baku dan Larutan sampel. Siapkan lima tingkat dosis larutan baku (S₁ – S₅) dan satu tingkat dosis larutan uji (U₃) masing-masing tiga replikat, terhadap lebih dari 20 sampel sesuai dengan dosis tengah larutan baku (S₃).

    Susun tabung dalam rak atau pembawa lain. Sertakan dalam tiap rak 1-2 tabung blangko yang berisi 1 mL pengencer uji tanpa antibiotik seperti tertera pada Tabel 7. Tambahkan volume larutan baku dan larutan uji seperti tertera pada Tabel 10. Susun satu set lengkap secara acak termasuk blangko dalam satu rak tabung. Tambahkan volume inokula sesuai Tabel 10 dalam tiap tabung menurut giliran, dan masukkan rak lengkap ke dalam inkubator atau tangas air dengan suhu yang dipertahankan seperti tertera pada Tabel 8 dan waktu inkubasi seperti tertera pada Tabel 11.

    Setelah inkubasi, pertumbuhan mikroba segera dihambat dengan menambahkan 0,5 mL formaldehida encer pada setiap tabung kecuali untuk tilosin. Untuk tilosin, panaskan rak dalam tangas air 80-90° selama 2 – 6 menit atau tangas uap selama 5 – 10 menit, dan biarkan pada suhu ruang. Analisis satu rak sekaligus dan ukur serapan atau transmitan pada 530 atau 580 nm.

Tabel 7

^a     µg dalam kolom ini menyatakan µg aktivitas.

^b     Penetapan cara lempeng dapat digunakan sebagai prosedur alternatif.

^c        Huruf D menyatakan Dapar seperti tertera pada Media dan Larutan, Dapar untuk menjelaskan setiap Dapar dalam tabel ini.

^d     Encerkan larutan persediaan100 µg/mL dengan Dapar D.3 untuk memperoleh larutan neomisin dosis setara 25 µg/mL. Pada labu tentukur 50-mL yang terpisah, pipet larutan masing-masing 1,39; 1,67; 2,00; 2,40; dan 2,88 mL. Tambahkan pada tiap labu 5,0 mL asam hidroklorida 0,01 N, encerkan dengan Dapar D.3 sampai tanda dan campur hingga diperoleh larutan neomisin dosis 0,69; 0,83; 1,00; 1,20; dan 1,44 µg/mL. Gunakan larutan ini untuk membuat garis respons baku

Tabel 8