Definisi dan prosedur umum berikut digunakan untuk lemak, minyak lemak, malam, resin, balsam dan zat-zat sejenis.

    Penyiapan Contoh Bila contoh minyak menunjukkan kekeruhan yang disebabkan oleh pemisahan stearin, hangatkan wadah dalam tangas air pada suhu 50° sampai minyak jernih, atau bila minyak pada penghangatan tidak menjadi jernih, saring melalui kertas saring kering pada corong yang terletak di dalam mantel air panas. Campur dengan baik, dan timbang sekaligus sebanyak yang diperlukan untuk berbagai penetapan, sebaiknya menggunakan botol berpipet tetes, atau buret timbang. Jaga contoh tetap meleleh, jika pada suhu kamar berupa padatan, sampai diperoleh sejumlah yang diperlukan.

    Bobot Jenis Tetapkan bobot jenis lemak atau minyak lemak seperti tertera pada Penetapan Bobot Jenis  <981>.

    Suhu Lebur Tetapkan suhu lebur seperti tertera pada Penetapan Jarak Lebur atau Suhu Lebur  <1021> Metode lV.

Bilangan Asam (Asam Lemak Bebas) Keasaman lemak dan minyak lemak dinyatakan sebagai jumlah mL alkali 0,1 N yang diperlukan untuk menetralkan asam bebas dalam 10,0 g zat. Keasaman sering dinyatakan sebagai Bilangan asam, yaitu jumlah mg kalium hidroksida yang diperlukan untuk menetralkan asam bebas dalam 1,0 g zat.  Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, gunakan Metode I.

Metode I

    Prosedur Kecuali dinyatakan lain, timbang saksama lebih kurang 10,0 g zat, larutkan dalam labu yang berisi 50 mL campuran sama banyak etanol P-eter P  dan telah dinetralkan terhadap fenoftalein LP dengan kalium hidroksida 0,1 N atau natri­um hidroksida 0,1 N, kecuali dinyatakan lain.  Bila contoh tidak larut dalam pelarut dingin, hubungkan labu dengan pendingin yang sesuai dan hangatkan perlahan-lahan, sambil sering dikocok sampai contoh larut. Tambahkan 1 mL fenolftalein LP, dan titrasi dengan kalium hidroksida 0,1 N LV  atau natrium hidroksida 0,1 N LV sampai larutan berwarna merah muda lemah yang tetap setelah dikocok selama 30 detik. Hitung Bilangan asam atau jumlah mL alkali 0,1 N yang diperlukan untuk menetralkan 10,0 g contoh (asam lemak bebas). Hitung Bilangan asam dengan rumus:

    56,11 adalah bobot molekul kalium hidroksida; V adalah volume, dalam mL; N adalah normalitas larutan kalium hidroksida atau larutan natrium hidroksida; W adalah bobot dalam g zat yang digunakan.

    Jika volume kalium hidroksida 0,1 N LV atau natrium hidroksida 0,1 N LV yang di­perlukan untuk titrasi kurang dari 2 mL, dapat digunakan titran lebih encer, atau jumlah contoh disesuaikan. Hasil dapat dinyatakan dalam volume titran yang digunakan atau dalam kesetaraan volume kalium hidroksida 0,1 N  atau natrium hidroksida 0,1 N.

    Jika minyak telah dijenuhkan dengan karbon dioksida untuk tujuan pengawetan, refluks perlahan-lahan larutan etanol-eter selama 10 menit sebelum titrasi. Minyak juga dapat dibebaskan dari karbon dioksida dengan menempatkannya pada cawan dangkal di dalam desikator vakum selama 24 jam sebelum contoh ditimbang.

Metode II

    Prosedur Buat 125 mL campuran sama banyak isopropanol P dan toluen P. Sebelum digunakan, tambahkan 2 mL larutan fenoftalein P 1% dalam isopropanol P dan netralkan dengan basa sampai berwarna merah muda lemah. Timbang saksama sejumlah contoh cair, yang telah tercampur baik, seperti tertera pada tabel di bawah ini dan larutkan dalam campuran  larutan  yang sudah dinetralkan. Bila contoh tidak larut dalam pelarut dingin, hubungkan labu dengan pendingin yang sesuai dan hangatkan perlahan-lahan, sambil sering dikocok sampai contoh larut. Kocok kuat selama titrasi dengan kalium hidroksida 0,1 N LV atau natrium hidroksida 0,1 N LV sampai berwarna merah muda dengan intensitas yang sama dengan pelarut yang sudah dinetralkan. Hitung jumlah asam lemak seperti tertera pada Metode I.

Bilangan Ester adalah jumlah mg kalium hidroksida yang diperlukan untuk menyabunkan ester dalam 1,0 g zat. Jika Bilangan penyabunan dan Bilangan asam telah ditetapkan, selisih antara keduanya menunjukkan Bilangan ester, Bilangan ester = Bilangan penyabunan – Bilangan asam.

    Prosedur Timbang saksama sejumlah 1,5 g hingga 2 g zat dalam labu 250 mL yang telah ditara, tambahkan 20 mL hingga 30 mL etanol P yang telah dinetralkan, kocok. Tambahkan 1 mL fenolftalein LP, dan titrasi dengan kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV sampai asam bebas dinetralkan. Tambahkan 25,0 mL kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV, lakukan seperti tertera pada Bilangan penyabunan mulai dengan "Panaskan labu ..." dan abaikan penambahan fenolftalein LP. Hitung Bilangan ester dengan rumus:

56,11 adalah bobot molekul kalium hidroksida; V_T dan V_B berturut-turut adalah volume dalam mL dari asam hidroklorida 0,5 N yang diperlukan dalam penetapan contoh dan penetapan blangko; N adalah normalitas larutan asam hidroklorida; W adalah bobot dalam g zat yang digunakan.

Bilangan Hidroksil adalah jumlah mg kalium hidroksida yang setara dengan kandungan hidroksil dalam 1,0 g zat.

    Pereaksi piridina-anhidrida asetat Buat campuran segar, 3 bagian volume piridina P yang baru dibuka atau baru didestilasi dengan 1 bagian volume anhidrida asetat P yang baru dibuka atau baru didestilasi.

    Prosedur Timbang saksama sejumlah zat sesuai dengan tabel di bawah ini, masukkan ke dalam labu Erlen­meyer bersumbat kaca 250 mL, dan tambahkan 5,0 mL Pereaksi piridina-anhidrida asetat. Masukkan 5,0 mL Pereaksi piridina-anhidrida asetat, sebagai blangko ke dalam labu Erlenmeyer bersumbat kaca 250 mL kedua. Hubungkan kedua labu dengan pendingin refluks dengan sambungan asah yang sesuai, panaskan di atas tangas uap selama 1 jam, pada masing-masing labu tambahkan 10 mL air melalui pendingin, dan panaskan lagi di atas tangas uap selama 10 menit. Dinginkan, dan ke dalam masing-masing labu tambahkan 25 mL butanol P, yang telah dinetralkan terhadap fenolftalein LP dengan kalium hidroksida-etanol 0,5 N, dengan menuangkan 15 mL melalui masing-masing pendingin dan setelah pendingin dilepas, bilas dinding kedua labu dengan 10 mL sisanya. Ke dalam masing-masing labu tambahkan 1 mL fenolftalein LP, dan titrasi dengan kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV. Catat volume dalam mL, yang diperlukan pada penetapan larutan uji sebagai T dan yang diperlukan oleh blangko sebagai B. Dalam labu Erlenmeyer 125 mL, campur lebih kurang 10 g zat yang ditimbang saksa­ma, dengan 10 mL piridina P yang baru didestilasi, dan telah dinetralkan terhadap fenolftalein LP, tambahkan 1 mL fenolftalein LP, dan titrasi dengan kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV, catat volume dalam mL, yang digunakan oleh asam bebas dalam contoh sebagai A. Hitung Bilangan hidroksil dengan rumus:

W dan C berturut-turut adalah  bobot dalam g zat yang digunakan untuk asetilasi dan untuk penetapan asam bebas; N adalah normalitas kalium hidroksida-etanol; 56,11 adalah bobot molekul kalium hidroksida. Jika Bilangan asam dalam zat sudah diketahui, hitung Bilangan hidroksil dengan rumus:

W adalah bobot dalam g zat yang digunakan dalam asetilasi; N adalah normalitas kalium hidroksida-etanol; 56,11 adalah bobot molekul kalium hidroksida.

Bilangan lodum adalah jumlah g iodum yang diserap oleh 100 g zat, pada kondisi yang ditetapkan. Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, tetapkan Bilangan iodum dengan Metode I.

Metode I (Metode Hanus)

    Prosedur Timbang saksama sejumlah zat sesuai dengan tabel di bawah ini, masukkan ke dalam labu iodum 250 mL, larutkan dalam 10 mL kloroform P, tambahkan 25,0 mL iodobromida LP, tutup rapat, biarkan selama 30 menit di tempat terlindung cahaya, dengan sesekali dikocok. Tambahkan berturut-turut 30 mL kalium iodida LP dan 100 mL air, dan titrasi iodum yang dibebaskan dengan natrium tiosulfat 0,1 N LV, kocok kuat-kuat setelah setiap penambahan tiosulfat. Bila warna iodum menjadi agak pucat, tambahkan 3 mL kanji LP, dan lanjutkan titrasi dengan natrium tiosulfat 0,1 N LV hingga warna biru hilang. Lakukan penetapan blangko. Hitung Bilangan iodum dengan rumus:

126,9 adalah bobot atom Iodum, V_B dan V_S berturut-turut adalah volume natrium tio­sulfat 0,1 N LV yang digunakan untuk penetapan blangko dan penetapan contoh, dalam mL; N adalah normalitas kalium hidroksida-etanol; W adalah bobot contoh yang digunakan, dalam g. [Catatan Bila lebih dari setengah iodobromida LP diserap oleh contoh, ulangi penetapan dengan menggunakan contoh dalam jumlah lebih kecil].

Bobot Contoh

Metode II (Metode Wijs)

     Larutan Kalium iodida Timbang saksama lebih kurang 10 g kalium iodida P masukkan ke dalam labu tentukur 100-mL, larutkan dan encerkan dengan air sampai tanda. Simpan dalam wadah terlindung cahaya.

     Indikator Larutan Kanji  Campur 1 g kanji larut P dengan air agak dingin untuk membuat pasta.  Tambahkan air mendidih sampai dengan 100 mL sambil diaduk. Campur dan dinginkan. Gunakan hanya bagian yang jernih.

    Prosedur Lelehkan contoh, jika tidak dalam bentuk cair. [Catatan  Suhu selama pelelehan  tidak boleh lebih 10° dari titik leleh zat]. Saring melalui dua buah kertas saring untuk memisahkan cemaran padat dan  sisa lembab.  Penyaringan dapat dilakukan dalam oven pada 100° tetapi harus selesai dalam 5 menit ± 30 detik. Contoh harus benar-benar kering. Semua alat gelas harus benar-benar bersih dan kering. Setelah penyaringan, filtrat contoh  dikondisikan pada suhu 68° sampai 71±1° sebelum ditimbang. Setelah suhu 68° sampai 71±1° tercapai, contoh segera ditimbang, masukkan ke dalam labu iodum 500-mL, timbang saksama seperti tertera pada tabel.  [Catatan  Penimbangan contoh harus sedemikian rupa sehingga terdapat kelebihan iodoklorida LV 50% sampai 60% dari jumlah yang ditambahkan, yang berarti, 100% sampai 150% dari jumlah yang diabsorbsi]. Tambahkan 15 mL campuran segar sikloheksan P dan asam asetat glasial P (1:1), dan aduk untuk melarutkan contoh. Tambahkan 25 mL iodo klorida LP, tutup rapat dan goyang  hingga tercampur. Biarkan sampai suhu mencapai 25±5º, lindungi dari cahaya, dengan sesekali dikocok , selama 1 sampai 2 jam, tergantung dari Bilangan Iodum contoh; Bilangan Iodum kurang dari 150, 1 jam; Bilangan Iodum kurang lebih sama atau lebih dari 150, 2 jam. Kemudian dalam waktu 3 menit setelah waktu reaksi yang ditentukan, tambahkan secara berturut-turut 20 mL Larutan kalium iodida dan 150 mL air bebas karbondioksida P, campur. Dalam waktu 30 menit, titrasi iodum yang dibebaskan dengan natrium tiosulfat 0,1 N LV sambil diaduk secara mekanik setiap penambahan tiosulfat. Ketika warna kuning iodum hampir hilang, tambahkan 1 sampai 2 mL Indikator larutan kanji, dan lanjutkan titrasi sampai warna biru hilang. Lakukan titrasi blangko. Hitung Bilangan iodum dengan rumus yang sama pada perhitungan Metode I.

Bilangan Peroksida adalah jumlah yang menunjukkan, dalam miliekivalen, oksigen aktif, yaitu jumlah peroksida yang terkandung dalam 1000 g zat [Catatan Uji harus segera dilakukan setelah sampling untuk mencegah oksidasi dari zat yang diuji].

    Prosedur Jika tidak dinyatakan lain, timbang saksama lebih kurang 5 g zat ke dalam labu Erlenmeyer bersumbat kaca 250 mL.  Tambahkan 30 mL campuran asam asetat glasial P dan kloroform P (3:2), kocok untuk melarutkan, dan tambahkan 0,5 mL larutan jenuh kalium iodida P. Kocok selama 1 menit tepat dan tambahkan 30 mL air.  Titrasi dengan natrium tiosulfat 0,01 N LV secara perlahan dengan pengocokan terus menerus sampai warna kuning hampir hilang.  Tambahkan 5 mL Indikator larutan kanji LP, dan lanjutkan titrasi dengan pengocokan kuat sampai warna biru hilang. Lakukan penetapan blangko. [Catatan  Volume titran yang digunakan untuk blangko tidak lebih dari 0,1 mL]. Hitung Bilangan peroksida dengan rumus:

V_T dan V_B berturut-turut adalah volume dalam mL natrium tiosulfat 0,01 N LV yang digunakan untuk penetapan contoh dan penetapan blangko; N adalah normalitas natrium tiosulfat; W adalah bobot contoh yang digunakan dalam g.

Bilangan Penyabunan adalah jumlah mg kalium hidroksida yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas dan menyabunkan ester yang terkandung dalam 1,0 g zat.

    Prosedur Timbang saksama 1,5 g hingga 2 g zat, dalam labu 250 mL yang telah ditara dan tambahkan 25,0 mL kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV.  Panaskan labu diatas tangas uap, refluks dengan pendingin yang sesuai, selama 30 menit, sambil sering diputar. [Catatan Waktu refluks bisa mencapai 90 menit untuk memastikan sempurnanya proses penyabunan, tergantung dari tipe ester yang ditetapkan]. Kemudian tambahkan 1 mL fenolftalein LP, dan titrasi kelebihan kalium hidroksida dengan asam hidroklorida 0,5 N LV.  Lakukan penetapan blangko.  Titrasi dapat juga dilakukan dengan titrasi potensiometri. Hitung Bilangan penyabunan dengan rumus:

 56,11 adalah bobot molekul kalium hidroksida; V_T dan V_B berturut-turut adalah volume dalam mL asam hidroklorida 0,5 N LV yang digunakan dalam penetapan contoh dan penetapan blangko; N adalah normalitas asam hidroklorida; W adalah bobot contoh yang digunakan dalam g.

Jika minyak telah dijenuhkan dengan karbondioksida dengan tujuan pengawetan, tempatkan minyak tersebut pada cawan dangkal dalam desikator vakum selama 24 jam sebelum contoh ditimbang.

Zat Tak Tersabunkan dalam minyak atau lemak adalah zat yang tidak tersabunkan oleh alkali hidroksida, tetapi larut dalam pelarut  umum lemak, dan hasil penyabunan yang larut dalam pelarut tersebut.

    Prosedur Timbang saksama 5,0 g minyak atau lemak dalam labu Erlenmeyer 250 mL, tambahkan 50 mL larutan kalium hidroksida-etanol yang dibuat dari 12 g kalium hidroksida P dalam 10 mL air, dan encerkan dengan etanol sampai 100 mL, refluks di atas tangas uap, selama 1 jam, kocok secara berkala. Dinginkan sampai suhu dibawah 25º, pindahkan larutan ke dalam corong pisah dengan kran terbuat dari politetrafluoroetilena, bilas labu dua kali, tiap kali dengan 50 mL air yang dimasukkan ke dalam corong pisah (jangan gunakan lemak pada kran). Ekstraksi tiga kali, tiap kali dengan 100 mL eter P, masukkan kumpulan ekstrak eter ke dalam corong pisah lain yang berisi 40 mL air. Putar perlahan atau kocok corong pisah selama beberapa menit. [Catatan  Pengocokan keras menyebabkan terbentuk emulsi yang sukar dipisahkan]. Biarkan campuran memisah dan buang lapisan bawah fasa air. Cuci ekstrak eter sebanyak dua kali, tiap kali dengan 40 mL air, dan buang lapisan bawah fasa air. Cuci ekstrak eter berturut-turut dengan 40 mL larutan kalium hidroksida P (3 dalam 100) dan 40 mL air. Ulangi pencucian menggunakan larutan kalium hidroksida-air sebanyak tiga kali. Cuci kembali kumpulan ekstrak dengan 40 mL air sampai cucian terakhir tidak memberikan warna merah pada penambahan 2 tetes fenol­ftalein LP. Masukkan ekstrak eter ke dalam gelas piala yang telah ditara, dan bilas corong pisah dengan 10 mL eter P, tambahkan bilasan ke dalam gelas piala. Uapkan eter di atas tangas uap hingga hampir kering, dan tambahkan 6 mL aseton P pada residu. Uapkan aseton dengan udara mengalir dan keringkan residu pada suhu 105° sampai antar penimbangan berbeda tidak lebih dari 1 mg._. Hitung persentase dari zat tak tersabunkan dalam minyak atau lemak dengan rumus :

W_R adalah bobot, dalam g, residu; W_S  adalah bobot, dalam g, minyak atau lemak dari zat uji.

Larutkan residu dalam 20 mL etanol P, yang telah dinetralkan terhadap fenoftalein LP, tambahkan fenoftalein LP dan titrasi dengan natrium hidroksida-etanol 0,1N LV, sampai larutan berwarna merah muda yang tetap selama tidak kurang dari 30 detik. Jika volume natrium hidroksida-etanol 0,1N LV yang diperlukan untuk titrasi lebih dari 0,2 mL, pemisahan lapisan belum lengkap; bobot residu tidak dapat dinyatakan sebagai zat tak tersabunkan, dan pengujian harus diulang.

Suhu Pemadatan Asam Lemak

    Penyiapan asam lemak Panaskan 75 mL Larutan gliserin-kalium hidroksida (dibuat dengan melarutkan 25 g kalium hidroksida P dalam 100 mL gliserin P) dalam gelas piala 800 mL hingga suhu 150°, dan tambahkan 50 mL lemak yang telah dijernihkan, dan jika perlu dilelehkan. Panaskan campuran selama 15 menit sambil sering diaduk, tetapi hindarkan suhu lebih dari 150°. Penyabunan sempurna bila campuran menjadi homogen, tanpa ada partikel yang melekat pada meniskus gelas piala. Pindahkan ke dalam gelas piala atau cawan 800 mL berisi 500 mL air yang hampir mendidih, tambahkan perlahan-lahan 50 mL asam sulfat P (3:1), dan panaskan larutan, sambil sering diaduk, sampai asam lemak memisah dengan baik sebagai lapisan jernih. Cuci dengan air mendidih sampai bebas dari asam sulfat, kumpulkan asam lemak dalam gelas piala kecil, letakkan di atas tangas uap sampai air memisah dan asam lemak jernih, saring dalam keadaan panas ke dalam gelas piala kering, dan keringkan pada suhu 105° selama 20 menit. Masukkan asam lemak hangat ke dalam wadah yang sesuai, dan dinginkan dalam tangas es sampai membeku.

    Uji kesempurnaan penyabunan Masukkan 3 mL asam lemak yang telah kering ke dalam tabung reaksi, dan tambahkan 15 mL etanol P. Panaskan larutan hingga mendidih, dan tambahkan volume sama amonium hidroksida 6 N.  Diperoleh larutan jernih.

    Prosedur Gunakan alat yang sama seperti pada
Alat penetapan suhu beku dan lakukan penetapan seperti tertera pada Prosedur dalam Penetapan Suhu Beku <1101>, "suhu beku" dibaca sebagai "suhu pemadatan". Suhu pemadatan asam lemak diperoleh
dari harga rata-rata tidak kurang dari empat pembacaan berturut-turut titik tertinggi pada waktu suhu naik. 

Komposisi Asam Lemak

    Larutan baku  Buat campuran ester sesuai dengan komposisi kandungan ester pada masing-masing  monografi.  Larutan baku dapat mengandung komponen lain [Catatan Campuran ester tersedia secara komersial]. Komposisi campuran yang tersedia secara komersial adalah sebagai berikut :

Komposisi campuran lain yang tersedia secara komersial adalah sebagai berikut :

    Larutan uji   [Catatan  Jika dalam contoh terdapat asam lemak yang mengandung lebih dari 2 ikatan rangkap, hilangkan udara dari labu menggunakan gas nitrogen selama beberapa menit].  Timbang lebih kurang 100 mg contoh, masukkan ke dalam labu 50 mL yang terhubung dengan refluks-kondesor pendingin yang sesuai dan pengaduk magnet.  Tambahkan 4 mL larutan natrium hidroksida metanolik 0,5 N LP dan refluks sampai letupan lemak hilang  (biasanya 5 sampai 10 menit).  Tambahkan 5 mL  larutan yang dibuat dari 14 g boron trifluorida P dalam metanol P untuk membuat 100 mL,  goyang untuk mencampur dan refluks selama 2 menit.  Tambahkan 4 mL heptana untuk kromatografi P, melalui kondensor dan refluks selama 1 menit.  Dinginkan dan pindahkan kondensor, tambahkan lebih kurang 15 mL larutan natrium klorida P jenuh, kocok dan biarkan lapisan memisah. Masukkan lapisan heptana ke dalam labu yang sesuai melalui 0,1 g natrium sulfat anhidrat P  yang telah dibilas dengan heptana untuk kromatografi P.  Pipet 1 mL larutan tersebut ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan heptana untuk kromatografi P sampai tanda. 

    Larutan kesesuaian sistem  Timbang lebih kurang 20 mg masing-masing  asam stearat, asam palmitat dan asam oleat, masukkan ke dalam labu 25 mL yang terhubung dengan refluks-kondensor pendingin yang sesuai dan pengaduk magnet dan lakukan sesuai prosedur pada larutan uji, mulai dari “Tambahkan 5,0 mL larutan yang dibuat dengan melarutkan”.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala yang dipertahankan pada suhu 260º, sistem injeksi splitless dan kolom kapiler leburan silika 0,53 mm x 30 m, yang dilapisi fasa G16 dengan ketebalan 1,0 µm. Pertahankan suhu kolom pada 70° selama 2 menit setelah penyuntikan, kemudian naikkan dengan kecepatan 5º per menit hingga suhu 240º, pertahankan selama 5 menit.  Pertahankan suhu injektor lebih kurang 220º dan laju alir gas helium P lebih kurang 50 cm per detik.

    Suntikkan Larutan kesesuaian sistem dan rekam respons puncak seperti tertera pada Prosedur: waktu retensi relatif  untuk metil palmitat, metil stearat dan metil oleat berturut-turur lebih kurang 0,87; 0,99 dan 1,0; resolusi, R, antara puncak metil stearat dan metil oleat tidak kurang dari 1,5 dan simpangan baku relatif dari repons puncak palmitat dan stearat pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 6,0%.  Simpangan baku relatif dari perbandingan respons puncak palmitat terhadap stearat pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 1,0%.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 1 µl) Larutan baku dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram, identifikasi puncak  ester asam lemak dari kromatogram Larutan uji dengan membandingkan waktu retensi puncak dari  kromatogram Larutan baku. Ukur luas puncak dari semua puncak ester asam lemak  kromatogram Larutan uji. Hitung persentase dari masing-masing komponen asam lemak dalam contoh dengan rumus :

A adalah respons puncak dari masing-masing komponen ester asam lemak;  B adalah jumlah respons puncak dari semua puncak, kecuali puncak pelarut dari kromatogram Larutan uji.

Penetapan dan Profil Asam Lemak Omega-3

    Prosedur berikut digunakan untuk penetapan asam eikosapentaenoat (EPA) (C20:5 n-3), asam dokosa-heksaenoat (DHA) (C22:6 n-3) dan total asam omega-3 yang diperoleh dari ikan, tanaman, atau sumber mikroba dalam minyak mentah dan minyak terenkapsulasi. Lindungi larutan dari cahaya, senyawa pengoksidasi, katalis oksidasi dan udara.

Kandungan EPA dan DHA

     Baku Pembanding Etil Ester Asam Dokosaheksanoat BPFI; Etil Ester Asam Eikosapentanoat BPFI; Metil Trikosanoat BPFI.

    Larutan antioksidan Timbang saksama sejumlah tertentu butilat hidroksitoluena larutkan dalam        2,2,4-trimetilpentana P  untuk mendapatkan larutan dengan kadar 0,05 mg per mL.

    Larutan baku internal Timbang saksama sejumlah Metil Trikosanoat BPFI, masukkan dalam labu tentukur yang sesuai. Larutkan dan encerkan dengan Larutan antioksidan hingga diperoleh larutan dengan kadar lebih kurang 7,0 mg per mL. [Catatan Lindungi larutan terhadap penguapan selama pengujian].

    Larutan uji 1 (untuk trigliserida) Timbang saksama lebih kurang sejumlah contoh seperti tertera pada tabel masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan antioksidan sampai tanda. Pipet 2 mL larutan ke dalam tabung reaksi, uapkan pelarut dengan mengalirkan nitrogen P secara perlahan. Tambahkan 1,5 mL natrium hidroksida P 2% dalam metanol, tutup rapat dengan tutup politetrafluoroetilen, campur, dan panaskan dalam tangas air selama 7 menit. Dinginkan, tambahkan 2 mL larutan boron triklorida P dalam  metanol P (120 g dalam 1000 mL), alirkan nitrogen P, tutup rapat, campur, dan panaskan dalam tangas air selama 30 menit. Dinginkan hingga suhu 40° sampai 50°, tambahkan 1 mL 2,2,4-trimetilpentana P, tutup, dan campur menggunakan vortex atau kocok kuat selama tidak kurang dari 30 detik. Segera tambahkan 5 mL larutan natrium klorida P jenuh yang mengandung 1 bagian natrium klorida dan 2 bagian air. [Catatan Kocok setiap kali proses. Sebelum digunakan, pisahkan larutan dari zat yang tidak larut, saring bila perlu]. Alirkan nitrogen P, tutup, dan campur dengan vortex atau kocok kuat selama tidak kurang dari 15 detik. Diamkan sampai lapisan atas jernih, pindahkan ke tabung yang lain. Kocok lapisan metanol sekali lagi dengan 1 mL 2,2,4-trimetilpentana P, dan kumpulkan ekstrak 2,2,4-trimetilpentana. Cuci kumpulan ekstrak 2 kali, masing-masing dengan 1 mL air, dan keringkan melalui natrium sulfat anhidrat P.

    Larutan uji 2 (untuk trigliserida) Timbang saksama lebih kurang sejumlah sama contoh seperti yang digunakan pada penyiapan Larutan uji 1, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan baku internal sampai tanda. Lakukan penyiapan seperti pada Larutan uji 1, dimulai dengan “Pipet 2 mL larutan ke dalam tabung reaksi”.

    Larutan uji 3 (untuk etil ester) Timbang saksama lebih kurang sejumlah contoh seperti tertera pada tabel, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan baku internal sampai tanda.

    Larutan uji 4 (untuk etil ester) Timbang saksama lebih kurang sejumlah sama contoh seperti yang digunakan pada penyiapan Larutan uji 3, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan antioksidan sampai tanda.

    Larutan baku 1 Timbang saksama lebih kurang 0,10 g masing-masing Etil Ester Asam Dokosaheksanoat BPFI dan Etil Ester Asam Eikosapentanoat BPFI dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan baku internal sampai tanda.

    Larutan baku 2 Pipet 2 mL Larutan baku 1 ke dalam tabung reaksi, uapkan pelarut dengan mengalirkan nitrogen P secara perlahan. Lakukan penyiapan seperti pada Larutan uji 1, dimulai dengan “Tambahkan 1,5 mL natrium hidroksida P”.

    Larutan kesesuaian sistem 1 Timbang saksama lebih kurang 0,30 g masing-masing metil palmitat, metil stearat, metil arakidat dan metil behenat, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan antioksidan sampai tanda.

    Larutan kesesuaian sistem 2 Timbang saksama lebih kurang 55 mg metil ester asam dokosaheksanoat dan 5 mg metil ester asam tetrakos-15-enoat (asam nervonat), masukkan dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan Larutan antioksidan sampai tanda.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala dan kolom kapiler leburan silika 0,25 mm x 25 m, yang dilapisi fasa G16 dengan ketebalan 0,2 µm. Pertahankan suhu detektor dan injektor pada 270° dan 250º. Atur suhu awal kolom pada 170º selama 2 menit,  kemudian naikkan dengan kecepatan 3º per menit sampai 240º, pertahankan selama 2,5 menit. Gunakan Helium P sebagai gas pembawa dengan perbandingan split 1 : 200 dan laju alir lebih kurang 1 mL per menit. [Catatan Jika digunakan sistem injeksi splitless, larutan harus diencerkan 1 dalam 200]. Suntikkan Larutan kesesuaian sistem 1 dan Larutan kesesuaian sistem 2, rekam respons puncak seperti tertera pada Prosedur: dengan Larutan kesesuaian sistem 1, persen respons meningkat berturut-turut; metil palmitat, metil stearat, metil arakhidat, metil behenat; perbedaan persen respons antara metil palmitat dan metil behenat kurang dari 2,0 unit persen respons; dengan Larutan kesesuaian sistem 2, resolusi, R, antara metil ester asam dokosaheksanoat dan metil ester asam tetrakos-15-enoat tidak kurang dari 1,2. [Catatan Berkaitan dengan persyaratan kesesuaian sistem di atas, persyaratan berikut berlaku untuk analisis trigliserida tetapi tidak berlaku untuk etil ester]. Untuk trigliserida, lakukan kromatografi pada Larutan baku 1 dan Larutan baku 2, rekam respons puncak seperti tertera pada Prosedur: efisiensi derivatisasi untuk konversi dari asam lemak etil ester menjadi asam lemak metil ester tidak kurang dari 90,0% untuk masing-masing asam lemak (DHA dan EPA).

    Prosedur Suntikkan secara terpisah masing-masing dua kali dengan volume sama (lebih kurang 1 ?l) Larutan baku 1, Larutan baku 2, Larutan uji 1 (untuk trigliserida), Larutan uji 2 (untuk trigliserida), Larutan uji 3 (untuk etil ester), dan Larutan uji 4 (untuk etil ester) ke dalam kromatograf, rekam kromatogram, ukur respons puncak. Identifikasi waktu retensi puncak baku internal untuk membandingkan kromatogram Larutan uji 3 dan Larutan uji 4 (untuk etil ester). Hitung persentase EPA dan DHA dalam trigliserida dengan rumus:

F adalah faktor yang menggambarkan kandungan DHA (F = 0,921) dan EPA (F = 0,915) sebagai asam lemak bebas; C adalah kadar, dalam mg per mL, DHA atau EPA dalam Larutan baku 2; W adalah bobot, dalam mg, contoh yang digunakan dalam penyiapan Larutan uji 1; R_S adalah perbandingan respons puncak dari EPA atau DHA relatif terhadap baku internal pada kromatogram Larutan baku 2; R_U adalah respons puncak terkoreksi dari EPA atau DHA relatif terhadap baku internal pada kromatogram Larutan uji 1. R_U dihitung sebagai berikut:

r_U2 adalah respons puncak baku internal kromatogram pada Larutan uji 2; r_U1 adalah respons puncak yang berada pada waktu retensi yang sama dengan baku internal dari kromatogram Larutan uji 1; r_T1 adalah respons puncak dari EPA atau DHA pada kromatogram Larutan uji 1; dan r_T2 adalah respons puncak dari EPA atau DHA pada kromatogram Larutan uji 2. Hitung persentase etil ester dengan rumus:

F adalah faktor yang menggambarkan kandungan DHA (F = 0,921) dan EPA (F = 0,915) sebagai asam lemak bebas; C adalah kadar, dalam mg per mL, dari DHA atau EPA dalam Larutan baku 1; W adalah bobot, dalam mg, contoh yang digunakan dalam penyiapan Larutan uji 3; R_S adalah perbandingan respons puncak dari EPA atau DHA relatif terhadap baku internal pada kromatogram Larutan baku 1;     R_U adalah respons puncak terkoreksi dari EPA atau DHA relatif terhadap baku internal pada kromatogram Larutan uji 3. R_U dihitung sebagai berikut:

r_U2 adalah respons puncak baku internal pada kromatogram Larutan uji 3; r_U1 adalah respons puncak yang berada di waktu retensi yang sama dengan baku internal dari kromatogram Larutan uji 4; r_T1 adalah respons puncak dari EPA atau DHA pada kromatogram Larutan uji 4; dan r_T2 adalah respons puncak dari EPA atau DHA pada kromatogram Larutan uji 3.

Kandungan Total Asam Omega-3

    Hitung kandungan total asam omega-3 dengan rumus:

EPA + DHA + ((A_{n – 3} x (EPA + DHA))/(A_EPA + A_DHA))

EPA adalah kandungan dari EPA, dalam mg per g, diperoleh dari uji Kandungan EPA dan DHA; DHA adalah kandungan dari DHA, dalam mg per g, diperoleh dari uji Kandungan EPA dan DHA; A_{n – 3} adalah jumlah respons puncak sesuai dengan jumlah rantai C18 : 3 n-3, C18 : 4 n-3, C20 : 4 n-3, C21 : 5 n-3 dan C22 : 5 n-3 metil ester pada kromatogram Larutan uji 1 untuk trigliserida atau sesuai dengan etil ester pada kromatogram Larutan uji 3; A_EPA adalah respons puncak sesuai dengan etil ester EPA pada kromatogram Larutan uji 3 untuk etil ester; dan  A_DHA adalah respons puncak sesuai dengan metil ester DHA pada kromatogram Larutan uji 1 untuk trigliserida atau puncak sesuai dengan etil ester DHA pada kromatogram Larutan uji 3.

Air dan Sedimen dalam Minyak Lemak

    Alat Alat sentrifus, sebaiknya mempunyai diameter ayunan (d = jarak dari ujung ke ujung tabung berputar) 38 cm sampai 43 cm dan dijalankan pada kecepatan lebih kurang 1500 rpm. Jika diguna­kan sentrifuga dengan dimensi berbeda, hitung kecepatan putaran yang diinginkan dengan rumus:

Tabung sentrifuga berbentuk buah pir, dengan sumbat yang sesuai. Kapasitas total tiap tabung lebih kurang 125 mL. Pembagian skala jelas dan dapat dibedakan, dengan pembacaan dari dasar tabung menurut skala seperti tertera pada tabel berikut :

        Volume (mL)                     Pembagian skala (mL)

    Prosedur Masukkan masing-masing 50,0 mL benzen P ke dalam 2 tabung sentrifuga, dan ke dalam tiap tabung tambahkan 50,0 mL minyak, hangatkan jika perlu untuk menggabungkan kembali stearin yang terpisah, dan campur kuat-kuat pada suhu 25°. Tutup rapat tabung, dan kocok kuat sampai isinya benar-benar tercampur, kemudian celupkan tabung ke dalam tangas air pada suhu 50° selama 10 menit. Sentrifus selama 10 menit. Baca volume campuran air dan sedimen pada dasar tiap tabung. Sentrifus berulang-ulang, setiap 10 menit sekali hingga volume campuran air dan sedimen tetap konstan pada tiga kali pembacaan berturut-turut.  Jumlah volume campuran air dan sedimen dalam kedua tabung menunjukkan persentase, dalam volume, dari air dan sedimen dalam minyak.

Bilangan Anisidin

    Bilangan anisidin adalah 100 kali pengukuran kerapatan optik dalam sel 1-cm dari larutan yang mengandung 1 g zat  dalam 100 mL campuran pelarut dan pereaksi seperti pada metode berikut. [Catatan  Lakukan penetapan secepat mungkin untuk menghindarkan paparan cahaya].

    Larutan uji A  Larutkan 0,5 g zat dengan isooktan P, encerkan hingga 25,0 mL.

    Larutan uji B  Pipet 5 mL Larutan uji A,  tambahkan 1,0 mL larutan p-anisidin P 2,5 g per  liter  dalam asam asetat glasial P, kocok, simpan terlindung cahaya.

    Larutan baku  Pipet 5 mL isooktan P, tambahkan 1,0 mL dari larutan p-anisidin P 2,5 g per  liter dalam asam asetat glasial P, kocok, simpan terlindung cahaya.

    Prosedur  Ukur serapan Larutan uji A pada 350 nm menggunakan isooktan P sebagai blangko. Ukur serapan Larutan uji B pada 350 nm tepat 10 menit setelah disiapkan, gunakan Larutan baku sebagai pembanding. Hitung Bilangan anisidin dengan rumus:

A_S adalah serapan dari Larutan uji B pada 350 nm; A_b adalah serapan dari Larutan uji A pada 350 nm; m adalah bobot, dalam g, dari Larutan uji A.

Bilangan Total Oksidasi (Totox)

Bilangan total oksidasi dinyatakan dengan rumus:

2PV + AV

PV adalah Bilangan Peroksida

AV adalah Bilangan Anisidin

Cemaran Logam

Alat

    Labu destruksi Gunakan tabung politetrafluoroetilen dengan volume lebih kurang 120 mL, dengan penutup yang sesuai, berkatup untuk mengatur tekanan udara di dalam wadah, dan tabung politetrafluoroetilen untuk melepaskan gas.

    Sistem Pastikan tabung kedap udara, gunakan tekanan yang sama untuk masing-masing tabung.

    Oven ”microwave” Mempunyai frekuensi magnet pada 2450 MHz, dengan output 0 sampai 630 ± 70 W dengan peningkatan 1%, program komputer digital, dinding yang dilapisi politetrafluoroetilen dengan “exhaust fan” yang kecepatannya bervariasi, sistem rotasi, dan saluran pembuangan untuk melepaskan gas.

    Spektrofotometer Serapan Atom Merupakan peralatan dengan lampu katoda-berongga sebagai sumber radiasi dan lampu deuterium sebagai korektor latar belakang; sistem terdiri dari:

1.       Tungku Grafit sebagai alat atomisasi untuk kadmium, tembaga, besi, timbal, nikel dan zink.

2.       Sistem otomatis pembentukan aliran uap hidrida berkesinambungan (“continuous-flow hydride vapor generation”) untuk arsen dan raksa.

Prosedur Umum

    [Peringatan Standar keselamatan dan instruksi pengoperasian alat labu destruksi tekanan tinggi dan “microwave” harus diikuti sesuai prosedur.]

    [Catatan Jika digunakan peralatan dengan spesifikasi yang berbeda, perlu dilakukan penyesuaian terhadap parameter peralatan].

    Pencucian Cuci alat gelas dan perlengkapan laboratorium dengan larutan asam nitrat P 10 mg per mL sebelum digunakan.

    Asam nitrat bebas cemaran logam Asam nitrat P yang memenuhi persyaratan nilai maksimum arsen (As), kadmium (Cd), tembaga (Cu), besi (Fe), raksa (Hg), timbal (Pb), nikel (Ni) dan zink (Zn) berturut-turut setara 0,005 bpj; 0,005 bpj; 0,001 bpj; 0,02 bpj; 0,002 bpj;  0,001 bpj; 0,005 bpj dan 0,01 bpj.

    Asam hidroklorida bebas cemaran logam Asam hidroklorida P yang memenuhi persyaratan nilai maksimum As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni dan Zn berturut-turut setara 0,005 bpj; 0,003 bpj; 0,003 bpj; 0,05 bpj; 0,005 bpj; 0,001 bpj; 0,004 bpj dan 0,005 bpj.

    Asam sulfat bebas cemaran logam Asam sulfat P yang memenuhi persyaratan nilai maksimum As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni dan Zn berturut-turut setara 0,005 bpj; 0,002 bpj; 0,001 bpj; 0,05 bpj; 0,005 bpj; 0,001 bpj;  0,002 bpj dan 0,005 bpj.

    Larutan uji persediaan Timbang saksama lebih kurang 0,5 g minyak lemak dalam labu destruksi, seperti tertera pada masing-masing monografi. Tambahkan 6 mL Asam nitrat bebas cemaran logam dan 4 mL Asam hidroklorida bebas cemaran logam. Sumbat labu.

    Larutan blangko persediaan Campur 6 mL Asam nitrat bebas cemaran logam dan 4 mL Asam hidroklorida bebas cemaran logam  ke dalam labu destruksi.

    Larutan uji 1 Masukkan labu destruksi yang berisi Larutan uji persediaan ke dalam oven “microwave”. Destruksi dengan tiga tahap proses berikut: energi 80% selama 15 menit, energi 100% selama 5 menit dan energi 80% selama 20 menit. Setelah selesai proses destruksi biarkan labu menjadi dingin. Tambahkan 4 mL Asam sulfat bebas cemaran logam P. Ulangi proses destruksi, biarkan labu menjadi dingin sampai suhu kamar. Buka labu destruksi dan pindahkan larutan jernih dan tidak berwarna yang diperoleh ke dalam labu tentukur 50-mL. Bilas labu destruksi dua kali masing-masing dengan 15 mL air dan gabungkan air bilasan ke dalam labu tentukur tersebut. Tambahkan 1,0 mL larutan magnesium nitrat P 10 mg per mL dan 1,0 mL larutan amonium dihidrogen fosfat P 100 mg per mL ke dalam labu. Encerkan dengan air sampai tanda dan campur.

    Larutan blangko 1 Masukkan labu destruksi berisi Larutan blangko persediaan ke dalam oven “microwave”. Lakukan prosedur seperti tertera pada Larutan uji 1 mulai dari “Destruksi dengan tiga tahap proses berikut”.

    Kalibrasi  langsung [Catatan Kadar larutan baku tergantung dari kandungan logam dari contoh uji]. Untuk pengukuran rutin, diperlukan tiga larutan baku, Larutan blangko 1 dan Larutan uji 1.

    Gunakan Larutan uji 1 dan Larutan blangko 1 seperti tersebut di atas atau sesuai dengan monografi. Buat tidak kurang dari tiga larutan baku yang mengandung semua elemen logam yang akan diuji. Nilai serapan Larutan uji 1 yang diperoleh untuk masing-masing elemen logam harus berada dalam rentang kalibrasi. Semua pereaksi yang digunakan dalam pembuatan Larutan uji 1 ditambahkan dengan kadar yang sama dengan larutan baku.

    Ukur serapan masing-masing larutan dengan Spektrofotometer Serapan Atom dengan jumlah pengulangan yang sama untuk memperoleh pembacaan yang stabil.

    Buat kurva kalibrasi dari nilai rata-rata hasil pembacaan Larutan uji 1 sebagai fungsi kadar larutan baku. Hitung kadar elemen dalam Larutan uji 1 yang dihitung terhadap kurva yang diperoleh.

    Penambahan baku Masukkan sejumlah sama Larutan uji 1 yang dibuat sesuai dengan prosedur di atas atau sesuai dengan monografi ke dalam empat buah labu tentukur. Tambahkan larutan baku dengan kadar elemen uji yang diketahui ke dalam masing-masing labu dengan volume bertingkat sehingga diperoleh larutan dengan kadar elemen uji yang menaik untuk mendapatkan kurva dengan respons yang linear. Labu tanpa penambahan larutan baku ditandai sebagai larutan uji.

    Ukur serapan masing-masing larutan menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom, lakukan pengulangan pengukuran yang sama untuk masing-masing larutan untuk mendapatkan hasil pembacaan yang stabil.

    Buat kurva antara serapan larutan baku elemen uji terhadap kadar elemen uji. Ekstrapolasikan garis pada kurva hingga memotong sumbu x. Jarak antara titik perpotongan tersebut dengan titik nol merupakan kadar elemen uji dalam larutan uji.

Uji Spesifik

KADMIUM (Cd), TEMBAGA (Cu), BESI (Fe), TIMBAL (Pb), NIKEL (Ni) DAN ZINK (Zn)

    Larutan baku persediaan Buat larutan dengan kadar 5 µg per mL dari masing-masing elemen uji.

    Larutan baku Masukkan masing-masing 10 µl, 20 µl dan 40 µl Larutan baku persediaan ke dalam tiga buah labu tentukur 10-mL. Ke dalam masing-masing labu, tambahkan 0,1 mL larutan magnesium nitrat P 10 mg per mL; 0,1 mL larutan amonium dihidrogen fosfat P 100 mg per mL; 0,6 mL Asam nitrat bebas cemaran logam; 0,4 mL Asam hidroklorida bebas cemaran logam  dan 0,4 mL Asam sulfat bebas cemaran logam, campur. Tambahkan 5,0 mL Larutan uji 1 ke dalam masing-masing labu, encerkan dengan air sampai tanda, campur.

    Larutan uji 2 Masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL: 0,1 mL larutan magnesium nitrat P 10 mg per mL; 0,1 mL larutan amonium dihidrogen fosfat P 100 mg per mL; 0,6 mL Asam nitrat bebas cemaran logam; 0,4 mL Asam hidroklorida bebas cemaran logam dan 0,4 mL Asam sulfat bebas cemaran logam, campur. Tambahkan 5,0 mL Larutan uji 1, encerkan dengan air sampai tanda, campur.

    Larutan blangko 2 Masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL: 0,1 mL larutan magnesium nitrat P 10 mg per mL;  0,1 mL larutan amonium dihidrogen fosfat P 100 mg per mL; 0,6 mL Asam nitrat bebas cemaran logam; 0,4 mL Asam hidroklorida bebas cemaran logam dan 0,4 mL Asam sulfat bebas cemaran logam, campur. Tambahkan 5,0 mL Larutan blangko 1, encerkan dengan air sampai tanda, campur.

    Prosedur Ukur kandungan Cd, Cu, Fe, Pb, Ni dan Zn menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom dengan tungku grafit yang sesuai. Dalam waktu berurutan, ukur serapan Larutan blangko 1, Larutan baku dan Larutan uji 2 masing-masing tidak kurang dari tiga kali pengukuran. Nilai serapan Larutan blangko 2 sebagai koreksi dari nilai serapan Larutan baku dan Larutan uji 2. Lakukan seperti pada prosedur Penambahan baku dalam metode Prosedur umum di atas. Parameter alat yang dapat digunakan seperti tertera pada Tabel 1.

Tabel 1

ARSEN (As) DAN RAKSA (Hg)

    Ukur kandungan arsen dan raksa terhadap larutan baku arsen atau raksa pada kadar yang diketahui menggunakan metode Kalibrasi langsung pada Prosedur umum di atas, dengan sistem otomatis pembentukan aliran uap hidrida berkesinambungan.

    Untuk pengujian batas spesifikasi arsen 1 bpj dan raksa 1 bpj, buat tiga larutan baku kerja dengan kadar 5 ng per mL, 10 ng per mL dan 20 ng per mL untuk masing-masing elemen uji.

    Nilai serapan larutan blangko secara otomatis sebagai koreksi nilai serapan larutan uji.

    Arsen

    Larutan blangko 3 Tambahkan 1,0 mL larutan Kalium iodida P 200 mg per mL ke dalam 19,0 mL Larutan blangko 1. Biarkan larutan pada suhu ruang selama 50 menit atau pada suhu 70º selama 4 menit.

    Larutan uji 3 Tambahkan 1,0 mL larutan Kalium iodida P 200 mg per mL ke dalam 19,0 mL Larutan uji 1. Biarkan larutan pada suhu ruang selama 50 menit atau pada suhu 70º selama 4 menit.

    Pereaksi asam 1 Gunakan Asam hidroklorida bebas cemaran logam.

    Pereaksi pereduksi Larutan natrium tetrahidroborat P 6 mg per mL dalam natrium hidroksida P 5 mg per mL.

    Parameter alat dapat digunakan seperti tertera pada Tabel 2.

    Raksa

    Larutan blangko 4 Lakukan seperti pada Larutan blangko 3.

    Larutan uji 4 Lakukan seperti pada Larutan uji 3.

    Pereaksi asam 2 Gunakan Asam hidroklorida bebas cemaran logam 515 mg per mL.

    Pereaksi pereduksi 2 Larutan timah(II) klorida P 10 mg per mL dalam Asam hidroklorida bebas cemaran logam 200 mg per mL.

    Parameter alat dapat digunakan seperti tertera pada Tabel 2.

Tabel 2

KOMPOSISI STEROL

Pemisahan Fraksi Sterol

    Larutan pembanding A Timbang saksama sejumlah kolesterol dan larutkan dalam kloroform P hingga kadar 5% (b/v).

    Larutan uji A Timbang saksama lebih kurang 5 g zat uji dalam labu 250 mL. Tambahkan 50 mL kalium hidroksida-etanol 2 N, refluks secara perlahan dengan pengocokan kuat sampai terjadi penyabunan (larutan menjadi jernih). Lanjutkan pemanasan selama 20 menit, tambahkan 50 mL air dari atas kondensor. Dinginkan hingga suhu 30º. Pindahkan larutan ke dalam corong pisah 500-mL, bilas labu dengan air sampai volume kurang lebih 50 mL. Tambahkan lebih kurang 80 mL eter P, kocok kuat selama 30 detik dan biarkan memisah. [Catatan Emulsi dapat dihilangkan dengan menambahkan sedikit etanol atau metanol]. Pisahkan lapisan bawah fasa air dan kumpulkan ke dalam corong pisah yang lain. Lakukan ekstraksi kembali sebanyak dua kali pada fasa air-etanol, tiap kali menggunakan 60 sampai 70 mL eter P. Kumpulkan ekstrak eter ke dalam corong pisah, cuci dengan air tiap kali 50 mL, sampai air pencuci tidak bersifat basa terhadap fenolftalein LP. Saring fasa eter melalui natrium sulfat anhidrat P ke dalam labu 250 mL yang sudah ditara, cuci corong dan kertas saring dengan sedikit eter P. Destilasi eter hingga menjadi beberapa mL, keringkan dengan pengering hampa udara atau dengan aliran nitrogen P. Sempurnakan pengeringan pada suhu 100º selama lebih kurang 15 menit, dinginkan dalam desikator dan timbang. Larutkan zat tidak tersabunkan dalam kloroform P hingga diperoleh larutan dengan kadar lebih kurang 5%.

    Larutan uji B Timbang 5 g minyak kanola dan lakukan seperti pada Larutan uji A, mulai dari            “Tambahkan 50 mL kalium hidroksida-etanol 2 N”.

    Larutan uji C Timbang 5 g minyak biji bunga matahari dan lakukan seperti pada Larutan uji A, mulai dari “Tambahkan 50 mL kalium hidroksida-etanol 2 N”.

    Prosedur Lakukan Kromatografi lapis tipis seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Fase gerak Buat campuran toluena P - aseton P (95 : 5) atau campuran heksana P - eter P (65 : 35). Masukkan campuran dalam bejana kromatografi hingga tinggi larutan lebih kurang 1 cm. Tutup bejana dengan penutup yang sesuai, biarkan selama kurang lebih 30 menit. Garis penanda pada kertas saring yang dicelupkan ke dalam larutan dapat ditempatkan pada dinding dalam bejana. [Catatan Campuran Fase gerak sebaiknya diganti setiap kali pengujian untuk menjamin reprodusibilitas kondisi eluasi].

    Penjerap Campuran silika gel P dengan ukuran partikel 5-17 µm dan ketebalan lapisan 200 µm pada lempeng poliester 20 cm x 20 cm.

    Prosedur Rendam Penjerap dalam kalium hidroksida-etanol 0,2 N selama 10 detik, keringkan dalam lemari asam selama 2 jam dan panaskan pada suhu 100º selama 1 jam.  [Catatan Pindahkan dari alat pemanas tervalidasi dan simpan lempeng dalam desikator sampai waktunya digunakan. Lempeng harus digunakan dalam rentang waktu 15 hari. Lempeng kromatografi lapis tipis tanpa pengkondisian awal juga tersedia secara komersial]. Gunakan lempeng terpisah untuk masing-masing larutan uji.

    Totolkan 0,3 mL Larutan uji A lebih kurang 2 cm dari tepi bawah dengan ukuran bercak sekecil mungkin dan sama untuk masing-masing bercak. Sejajar dengan bercak tersebut, totolkan 2 sampai 3 µl Larutan pembanding A pada ujung lempeng. Masukkan lempeng dalam bejana kromatografi berisi Fase gerak,  biarkan Fase gerak mencapai lebih kurang 1 cm dari ujung atas lempeng. Angkat lempeng, tandai batas rambat, keringkan pada aliran udara panas [Catatan Hindarkan panas yang berlebihan] atau dengan cara menempatkan lempeng dalam lemari asam. Semprot lempeng  dengan 2,7-diklorofluoresin P 0,2% dalam etanol P dan amati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. [Catatan Lempeng yang dilapisi senyawa indikator UV juga tersedia secara komersial dengan tujuan penggunaan yang sama]. Pada masing-masing lempeng, tandai pita sterol yang sejajar dengan bercak Larutan pembanding A, termasuk pada daerah 2 sampai 3 mm di atas dan di bawah bercak yang sejajar dengan bercak Larutan pembanding A. Pindahkan silika gel pada bagian yang terdapat bercak ke atas penyaring kaca masir dengan septum berpori G3. Tambahkan 10 mL kloroform P panas, campur hati-hati dengan spatula logam, saring di bawah kondisi hampa udara, kumpulkan filtrat dalam labu yang dihubungkan dengan penyaring. Cuci residu dalam penyaring tiga kali masing-masing dengan 10 mL eter P dan kumpulkan filtrat dalam labu yang sama. Uapkan filtrat hingga volume 4 sampai 5 mL, pindahkan larutan residu ke dalam tabung uji berujung runcing dan bertutup ulir yang sebelumnya sudah ditimbang, uapkan hingga kering dengan pemanasan perlahan melalui aliran nitrogen P. Larutkan residu dengan beberapa tetes aseton P dan uapkan kembali hingga kering. Panaskan pada suhu 105º selama lebih kurang 10 menit, dinginkan dalam desikator dan timbang.

    Perlakukan Larutan uji B dan Larutan uji C sama seperti Larutan uji A.

Penetapan Sterol

    Larutan Uji D Ke dalam tabung uji yang mengandung fraksi sterol yang telah dipisahkan dari contoh uji menggunakan kromatografi lapis tipis, tambahkan campuran piridin anhidrat P-heksametildisilazan P-klorotrimetilsilan P (9:3:1) yang dibuat segar dengan perbandingan 50 µl untuk tiap mg sterol, hindarkan kondisi lembab. Sumbat tabung dengan rapat dan kocok hati-hati sampai sterol larut sempurna. Biarkan pada suhu ruang selama 15 menit dan sentrifugasi selama beberapa menit jika perlu. Gunakan beningan. [Catatan Kekeruhan tipis yang terbentuk adalah normal dan tidak menyebabkan anomali. Tetapi jika terbentuknya endapan putih keras atau terjadi warna merah muda menunjukkan adanya kelembapan atau kerusakan pereaksi. Jika hal ini terjadi, pengujian harus diulang].

    Larutan pembanding E Ke dalam 9 bagian sterol yang dipisahkan dari minyak kanola dengan kromatografi lapis tipis, tambahkan 1 bagian kolesterol. Lakukan yang sama seperti pada pembuatan Larutan uji D.

    Larutan pembanding F Lakukan pemisahan sterol dari minyak biji bunga matahari dengan kromatografi lapis tipis. Perlakukan sama seperti Larutan uji D.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan metode Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala dan kolom kaca atau kolom kapiler berisi leburan silika, yang berukuran 0,25 sampai 0,32 mm x 20 sampai 30 m, yang dilapisi fasa diam G27 atau G36 dengan ketebalan 0,10 sampai 0,30 µm. Pertahankan suhu injektor,  detektor dan kolom berturut-turut pada 280°, 290º dan 260 ± 5º. Gunakan helium P sebagai gas pembawa dengan kecepatan alir 20 sampai 35 cm per detik atau hidrogen P dengan kecepatan alir 30 sampai 50 cm per detik. Perbandingan celah 1 : 50 sampai 1 : 100. Suntikkan Larutan pembanding E dan Larutan pembanding F, rekam respons puncak seperti tertera pada Prosedur: waktu retensi ?-sitosterol 20 ± 5 menit dan semua puncak sterol yang ada terpisah. Kromatogram dari Larutan pembanding E menunjukkan empat puncak spesifik kolesterol, brasikasterol, kampesterol dan ?-sitosterol; kromatogram dari Larutan pembanding F menunjukkan empat puncak spesifik kampesterol, stigmasterol, ?-sitosterol dan ?7- stigmasterol. Waktu retensi untuk sterol dengan pembanding ?-sitosterol tertera pada Tabel 3.

Tabel 3. Waktu Retensi Relatif Sterol dengan Dua Kolom yang Berbeda

    Prosedur Suntikkan secara terpisah dengan volume sama (lebih kurang 1 ?l) Larutan uji D, Larutan pembanding E dan Larutan pembanding F, rekam kromatogram dan ukur respons puncak dari sterol. Hitung persentase dari masing-masing sterol dalam fraksi sterol zat uji dengan rumus:

A adalah respons puncak komponen sterol dari zat uji dan S adalah jumlah respons puncak komponen yang tertera dalam Tabel 3.