ENGUKURAN ULTRA VIOLET, CAHAYA TAMPAK, INFRAMERAH, SERAPAN ATOM, FLUORESENSI, TURBIDIMETRI, NEFELOMETRI DAN RAMAN

    Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektroskopi serapan ultra violet, cahaya tampak, inframerah dan serapan atom. Pengukuran spektrofotometri di dalam daerah cahaya tampak, semula disebut kolorimetri, tetapi istilah “kolorimetri” lebih tepat digunakan untuk persepsi tentang warna.

    Spektrofotometri fluorosensi merupakan pengukuran emisi cahaya dari suatu zat kimia selama diberi paparan ultra violet, cahaya tampak atau radiasi elektromagnetik lainnya. Pada umumnya cahaya yang diemisikan oleh larutan yang berfluorosensi mempunyai intensitas maksimum pada panjang gelombang yang biasanya 20 nm hingga 30 nm lebih panjang dari panjang gelombang radiasi eksitasi.

    Hamburan cahaya menyangkut pengukuran cahaya yang dihamburkan akibat tidak homogennya densitas optik submikroskopis dari larutan dan berguna dalam penentuan bobot molekul rata-rata sistem polidispersi dengan jangkauan bobot molekul dari 1000 sampai beberapa ratus juta. Dua teknik yang sering digunakan dalam analisa farmasi adalah turbidimetri dan nefelometri.

    Spektroskopi Raman (hamburan cahaya tidak elastis) merupakan proses hamburan cahaya yang contoh ujinya disinari dengan cahaya monokromatik kuat (biasanya cahaya laser) dan cahaya yang dihamburkan dari contoh tersebut dianalisis pergeseran frekuensinya.

    Jangkauan panjang gelombang yang tersedia untuk pengukuran membentang dari panjang gelombang pendek ultra violet sampai ke inframerah. Untuk mempermudah acuan, daerah spektrum ini pada garis besarnya dibagi dalam daerah ultra violet (190 hingga  380 nm), daerah cahaya tampak (380 hingga 780 nm), daerah inframerah dekat (780 hingga 3000 nm) dan daerah inframerah (2,5 hingga 40 mm atau 4000  hingga 250 cm^-1).

Kegunaan Komparatif Daerah Spektrum

    Untuk sebagian besar bahan farmasi pengukuran spektrum dalam daerah ultra violet dan cahaya tampak dapat dilakukan dengan ketelitian dan kepekaan yang lebih baik daripada dalam daerah inframerah dekat dan inframerah. Apabila larutan diamati dalam sel 1-cm dengan kadar lebih kurang 10 mg per mL contoh, sering menghasilkan serapan sebesar 0,2 hingga 0,8 di daerah ultra violet atau cahaya tampak. Di daerah inframerah dan inframerah dekat, diperlukan kadar berturut-turut sebesar 1 hingga 10 mg per mL dan sampai 100 mg per mL, untuk menghasilkan serapan yang memadai; untuk daerah spektrum ini biasanya dipakai sel dengan panjang           0,01 mm hingga 3 mm.

    Spektrum ultra violet dan cahaya tampak suatu zat pada umumnya tidak mempunyai derajat spesifikasi yang tinggi. Walaupun demikian, spektrum tersebut sesuai untuk pemeriksaan kuantitatif dan untuk berbagai zat, spektrum tersebut bermanfaat sebagai tambahan untuk identifikasi.

    Spektroskopi inframerah dekat, makin sering digunakan dalam analisis farmasi terutama untuk identifikasi cepat dengan jumlah contoh yang banyak dan juga untuk penetapan kadar air.

   Daerah inframerah dekat terutama sesuai untuk penetapan gugus –OH dan –NH, seperti air dalam alkohol, -OH dalam lingkungan amina, alkohol dalam hidrokarbon, dan amina primer dan sekunder dalam lingkungan amina tersier.

    Spektrum inframerah bersifat khas untuk suatu senyawa kimia tertentu, dengan pengecualian isomer optik yang mempunyai spektrum identik. Namun polimorfisme kadang-kadang dapat menyebabkan perbedaan dalam spektrum inframerah suatu senyawa tertentu dalam keadaan padat. Seringkali perbedaan kecil dalam struktur menghasilkan perbedaan yang signifikan dalam spektra. Karena banyaknya maksimum yang terdapat dalam spektra serapan inframerah, kadang-kadang dimungkinkan untuk melakukan pengukuran kuantitatif masing-masing komponen dari suatu campuran yang komposisi kualitatifnya diketahui tanpa pemisahan terlebih dahulu.

    Spektrum Raman dan spektrum inframerah memberikan data yang serupa, walaupun intensitas spektranya ditentukan oleh sifat molekul yang berlainan. Spektroskopi raman dan inframerah memperlihatkan kepekaan relatif yang berbeda untuk gugus fungsional yang berbeda, misalnya spektroskopi raman terutama sensitif terhadap ikatan rangkap C-S dan C-C, dan beberapa senyawa aromatik lebih mudah diidentifikasikan melalui spektra raman. Air mempunyai intensitas spektrum serapan inframerah yang sangat tinggi, tetapi spektrum ramannya sangat lemah. Oleh sebab itu, air hanya mempunyai daerah inframerah terbatas yang dapat digunakan untuk menguji zat terlarut dalam cairan mengandung air, sedangkan spektrum raman dari air hampir transparan seluruhnya dan berguna untuk identifikasi zat yang terlarut. Dua keterbatasan utama spektroskopi raman adalah kadar minimum spesimen yang dapat dideteksi biasanya 10^-2 hingga 10^-1 M dan bahwa cemaran yang terdapat dalam berbagai zat dapat berfluorosensi serta menggangu deteksi sinyal Raman yang terhamburkan.

    Pengukuran reflektansi optikal memberikan informasi spektral yang serupa dengan yang diperoleh pada pengukuran transmisi. Oleh karena pengukuran reflektansi hanya memeriksa komposisi permukaan contoh tersebut, kesulitan yang berkaitan dengan ketebalan optik serta sifat hamburan cahaya dari zat tersebut tereliminasi. Dengan demikian, sering kali pengukuran reflektansi dapat dilakukan dengan lebih sederhana pada bahan yang serapannya intensif. Suatu teknik yang biasa digunakan untuk pengukuran reflektansi inframerah dinamakan reflektansi total teratenuasi (RTA), juga dikenal sebagai reflektansi internal ganda (RIG). Dalam teknik RTA, berkas spektrofotometri inframerah dilewatkan melalui bahan jendela inframerah yang sesuai (misal KRS-5, suatu campuran etetik TIBr-TII), yang dipotong pada sudut sedemikian sehingga berkas inframerah memasuki permukaan pertama (depan) jendela, tetapi terefleksi secara total apabila berkas itu jatuh pada permukaan kedua (belakang) (artinya sudut jatuh radiasi pada permukaan yang kedua dari jendela melampaui sudut kritis untuk bahan tersebut). Dengan konstruksi jendela yang tepat, memungkinkan untuk memperoleh banyak refleksi internal dari berkas inframerah sebelum berkas ditransmisikan keluar jendela. Jika contoh ditempatkan melekat erat pada jendela sepanjang sisi yang merefleksi cahaya inframerah secara total, maka intensitas radiasi yang direfleksikan berkurang pada tiap panjang gelombang (frekuensi) yang diserap oleh contoh. Dengan demikian bila dibandingkan dengan pengukuran reflektansi sederhana, teknik RTA menghasilkan spektrum reflektansi yang bertambah intensitasnya sebanyak jumlah reflektansi berkas inframerah dalam jendela. Teknik RTA memberikan kepekaan yang baik, akan tetapi keberulangannya tidak baik dan bukan merupakan teknik kuantitatif yang dapat diandalkan, kecuali bila digunakan baku internal yang dicampurkan dengan baik sekali dengan setiap contoh uji.

    Spektrofotometri fluoresensi sering kali lebih sensitif daripada spektrofotometri serapan. Dalam pengukuran serapan, transmitan contoh dibandingkan dengan transmisi blangko; dan pada kadar rendah, larutan keduanya memberikan sinyal yang tinggi. Sebaliknya, pada spektrofotometri fluoresensi blangko pelarut memberikan luaran yang rendah,  sehingga radiasi latar belakang tidak menggangu penetapan pada kadar rendah menjadi berkurang. Hanya ada sedikit senyawa yang dapat ditetapkan dengan baik sekali pada kadar dibawah 10^-5 M dengan serapan cahaya, namun tidak luar biasa untuk menggunakan kadar dari 10^-7 M hingga 10^-8 M dalam spektrofotometri fluoresensi.

Teori dan Istilah

    Daya dari suatu berkas radiasi akan berkurang sehubungan dengan jarak yang ditempuhnya melalui medium penyerap. Daya tersebut juga akan berkurang sehubungan dengan kadar molekul atau ion yang terserap dalam medium tersebut. Kedua faktor tersebut menentukan proporsi dari kejadian total energi yang timbul. Penurunan daya radiasi monokromatis yang melalui medium penyerap yang homogen dinyatakan secara kuantitatif oleh Hukum Beer, log₁₀ (1/T) = A = abc; istilah tersebut didefinisikan sebagai berikut:

    Serapan [Simbol: A] Logaritma dasar 10 dari kebalikan transmitans (T). [Catatan Istilah yang digunakan sebelumnya meliputi densitas optik; absorbansi dan ekstingsi.]

    Daya serap [Simbol: a] adalah hasil bagi serapan (A) dibagi dengan hasil perkalian kadar yang dinyatakan dalam g per liter zat (c) dan panjang sel dalam cm (b).

    [Catatan Jangan dirancukan dengan indeks absorbansi; ekstingsi spesifik atau koefisien ekstingsi]

    Daya serap molar [Simbol: ?] Hasil bagi serapan (A) dengan hasil perkalian kadar zat, dinyatakan dalam mol per liter, dengan panjang serapan dalam cm. [Catatan: Istilah yang digunakan sebelumnya meliputi indeks serapan molar, koefisien ekstingsi molar dan koefisien serapan molar].

    Untuk sebagian besar sistem yang digunakan dalam spektrofotometri serapan, daya serap suatu zat merupakan konstanta yang tidak tergantung pada intensitas radiasi datang, panjang sel bagian dalam dan kadar, dengan demikian kadar dapat ditetapkan secara fotometri.

    Hukum Beer tidak menunjukkan adanya pengaruh suhu, panjang gelombang atau jenis pelarut. Untuk sebagian besar analisis pengaruh variasi suhu yang normal dapat diabaikan.

    Penyimpangan dari Hukum Beer dapat disebabkan oleh variabel kimia atau instrumen. Kegagalan Hukum Beer dapat disebabkan oleh perubahan kadar molekul terlarut sebagai akibat penggabungan antar molekul terlarut atau penggabungan antara molekul terlarut dan molekul pelarut, atau disosiasi atau ionisasi. Penyimpangan lain dapat disebabkan oleh pengaruh instrumen seperti radiasi polikromatis, pengaruh lebar celah atau cahaya yang menyimpang.

    Bahkan pada suhu tertentu dalam pelarut tertentu, daya serap tidak benar-benar konstan. Walaupun demikian dalam hal contoh hanya mempunyai satu komponen yang menyerap, tidak perlu sistem serapan tersebut memenuhi Hukum Beer untuk digunakan dalam analisa kuantitatif. Kadar yang tidak diketahui dapat diperoleh dengan membandingkan dengan suatu kurva baku yang ditetapkan secara eksperimental.

    Meskipun dalam pengertian yang eksak, Hukum Beer tidak berlaku dalam spektrofotometri serapan atom karena kurang pastinya panjang sel dan kadar, proses penyerapan yang terjadi dalam nyala api pada kondisi aspirasi yang berulang kembali, pada prinsipnya mengikuti Hukum Beer tersebut. khususnya logaritma negatif dari transmitans atau serapan berbanding lurus dengan koefisien absorpsi, jadi berbanding lurus dengan banyaknya atom yang menyerap. Atas dasar ini, kurva kalibrasi dapat dibuat untuk evaluasi nilai serapan yang tidak diketahui dalam arti kadar zat dalam larutan.

    Spektrum serapan  Suatu penampilan dalam bentuk grafik dari serapan atau fungsi dari serapan terhadap panjang gelombang atau suatu fungsi dari panjang gelombang.

    Transmitan [Simbol: T] Hasil bagi daya radiasi yang ditransmisikan oleh contoh dengan daya radiasi yang jatuh pada contoh tersebut. [Catatan Istilah yang digunakan sebelumnya termasuk transmitansi dan transmisi].

    Intensitas fluoresensi [Simbol: I] Suatu pernyataan empiris dari aktivitas fluoresensi, biasanya diberikan dalam unit berubah-ubah yang sebanding dengan respons detektor. Spektrum emisi fluoresensi merupakan suatu penyajian grafik dari distribusi spektrum radiasi yang diemisikan oleh suatu zat yang diaktifkan, yang menunjukkan intensitas radiasi yang diemisikan sebagai ordinat dan panjang gelombang sebagai absis. Spektrum eksitasi fluoresensi merupakan penyajian grafik dari spektrum aktivasi yang menunjukkan intensitas radiasi yang diemisikan oleh zat yang diaktifkan sebagai ordinat dan panjang gelombang radiasi yang mengaktifkan sebagai absis. Seperti dalam spektrofotometri serapan, daerah penting spektrum elektromagnetik yang dicakup oleh fluoresensi senyawa organik adalah daerah ultra violet, cahaya tampak, dan inframerah dekat, yaitu daerah dari 250 nm hingga 800 nm. Setelah molekul menyerap radiasi, energi dapat hilang sebagai panas atau dibebaskan dalam bentuk radiasi dengan panjang gelombang yang sama atau lebih panjang dari radiasi yang diserap. Baik serapan maupun emisi radiasi keduanya disebabkan oleh transisi elektron diantara tingkat energi atau orbital yang berbeda dari molekul. Terdapat penundaan waktu antara serapan dan emisi cahaya; interval waktu ini, yang menyatakan panjangnya waktu keadaan tereksitasi tersebut berlangsung, telah diukur lamanya lebih kurang 10^-9 detik hingga 10^-8 detik untuk sebagian besar larutan organik yang berflouresensi. Umur fluoresensi yang pendek tersebut membedakan tipe luminesensi dari fosforesensi yang umurnya panjang, dari 10^-3 detik sampai beberapa menit.

     Turbidansi [Simbol: S] Efek hamburan cahaya dari partikel yang tersuspensi. Jumlah zat yang tersuspensi dapat diukur dengan mengamati cahaya yang ditransmisikan (turbidimetri) atau yang dihamburkan (nefelometri).

    Turbiditas [Simbol: ?] Pada pengukuran hamburan cahaya, turbiditas merupakan ukuran bagi berkurangnya intensitas berkas datang per unit panjang suatu suspensi tertentu.

    Aktivitas hamburan Raman. Sifat molekul (dalam unit cm⁴ per g) yang menentukan intensitas pita Raman yang diamati untuk suatu contoh berorientasi acak. Aktivitas hamburan ditentukan dari derivatif  kemampuan polarisasi molekul terhadap gerak molekul yang menimbulkan pita pergeseran Raman. Pada umumnya, intensitas pita Raman berbanding lurus dengan kadar analit.

Penggunaan Baku Pembanding

    Dengan beberapa pengecualian, pengujian dan penetapan kadar secara spektrofotometri pada Farmakope memerlukan Baku Pembanding FI. Hal ini untuk memastikan bahwa pengukuran dilakukan pada kondisi yang sama untuk contoh uji dan zat pembanding. Kondisi tersebut mencakup penetapan panjang gelombang, pengaturan lebar celah, penempatan sel dan koreksi sel serta aras transmitannya. Perlu dicatat bahwa sel yang menunjukkan transmitan yang identik pada panjang gelombang tertentu dapat sangat berbeda transmitansinya pada panjang gelombang yang lain. Harus ditetapkan dan dilakukan koreksi sel yang tepat apabila diperlukan.

    Pernyataan “sediaan yang serupa” dan “larutan yang serupa” seperti yang digunakan dalam pengujian dan penetapan kadar secara spektrofotometri, menunjukkan bahwa bahan pembanding tersebut adalah Baku Pembanding FI, yang disiapkan dan diamati dengan cara yang praktis sama dengan yang digunakan untuk contoh uji. Biasanya dalam membuat larutan Baku Pembanding yang ditentukan, larutan disiapkan dengan kadar lebih kurang (sampai 10%) seperti yang diinginkan dan serapan jenis dihitung berdasarkan jumlah tepat yang ditimbang; jika tidak digunakan bahan Baku Pembanding yang telah dikeringkan sebelumnya, serapan jenis dihitung terhadap zat anhidrat.

    Pernyataan “tetapkan secara bersamaan” dan “ukur bersamaan” seperti yang digunakan dalam pengujian dan penetapan kadar secara spektrofotometri, memberikan petunjuk bahwa serapan larutan zat uji dan larutan zat pembanding, yang ditetapkan terhadap blangko, harus diukur berturut-turut dengan segera.

PERALATAN

    Tersedia beberapa jenis spektrofotometer. Pada dasarnya, umumnya jenis spektrofotometer melewatkan energi radiasi monokromatis ke contoh dalam bentuk yang sesuai, dan mengukur intensitas dari fraksi yang di transmisi, kecuali pada spektrofotometer IR. Spektrofotometer Fouirer Transform Infrared (FTIR) menggunakan teknik interferometri dimana radiasi polikromatis melewati analit ke dalam detektor berdasarkan intensitas dan waktu.  Spektrofotometer UV, cahaya tampak dan IR dispersif terdiri dari sumber energi, alat dispersi (misal prisma atau gratting), celah untuk seleksi pita panjang gelombang, sel atau wadah untuk zat uji, detektor energi radiasi, dilengkapi dengan amplifier dan alat pengukur. Pada spektrofotometer dioda array, energi dari sumber melewati zat uji dan kemudian didispersikan melalui gratting ke dalam beberapa ratus dioda peka cahaya yang masing-masing membentuk sinyal foton pada rentang panjang gelombang yang kecil, sinyal tersebut kemudian dikomputerisasi dengan cepat pada rentang terpilih yang mempresentasikan spektrum lengkap. Sistem FTIR menggunakan interferometer menggantikan alat dispersi dan komputer digital untuk memproses data spektra. Beberapa instrumen dioperasikan secara manual, sedangkan yang lainnya dioperasikan dengan otomatis dan merekam secara berkesinambungan. Alat yang digabungkan dengan komputer mempunyai kemampuan untuk menambah dan menyimpan spektra menampilkan perbandingan spektra, dan menunjukkan perbedaan dengan spektroskopi. (penyelesaian dengan penggunaan metode pengurangan absorbansi digital).

     Alat–alat tersebut dapat digunakan pada daerah spektrum cahaya tampak; cahaya tampak dan ultra violet (UV); cahaya tampak, UV dan inframerah (IR) dekat; dan pada daerah IR spektrum. Pemilihan jenis analisis spektrofotometri dan alat yang digunakan tergantung pada berbagai faktor seperti komposisi dan jumlah contoh uji yang tersedia, derajat akurasi, sensitivitas, dan selektifitas yang dikehendaki, dan perlakuan terhadap contoh uji.

     Alat yang digunakan pada spektrofotometer serapan atom mempunyai beberapa kemampuan khusus. Untuk tiap elemen yang ditetapkan sumber yang spesifik mengemisikan garis spektra untuk diserap harus dipilih. Sumber biasanya adalah lampu hollow katoda, suatu katoda yang dirancang untuk mengemisikan radiasi yang dikehendaki pada kondisi tereksitasi. Saat radiasi diserap oleh elemen contoh uji, biasanya pada panjang gelombang yang sama dengan garis emisinya, elemen pada lampu hollow katoda sama dengan elemen yang ditetapkan. Alat dilengkapi dengan aspirator untuk membawa contoh uji ke dalam nyala, yang biasanya dihasilkandari udara-asetilena, udara-hidrogen atau untuk kondisi refraktori, nitrogen oksida-asetilena. Nyala berpengaruh pada pemanasan bejana uji. Detektor digunakan untuk membaca sinyal dari bejana uji. Gangguan radiasi dari nyala selama pembakaran dapat ditiadakan dengan penggunaan sinyal yang terputus-putus dari lampu sumber pada frekuensi yang ditentukan. Detektor harus berada pada frekuensi alternatif supaya sinyal langsung yang berasal dari nyala diabaikan. Sistem deteksi, hanya membaca perubahan sinyal dari sumber hollow katoda, yang berbanding langsung dengan jumlah atom yang ditetapkan dari contoh uji. Untuk kebutuhan pemeriksaan obat, dipersyaratkan alat yang dapat membaca unit serapan secara langsung. Alat yang membaca persen transmitan, persen serapan atau konsentrasi dapat digunakan jika rumus perhitungan yang tertera pada masing-masing monografi disesuaikan sehingga memberikan  hasil kuantitatif. Persen serapan atau persen transmtan diubah menjadi serapan, A, dengan rumus sebagai berikut:

A = 2- log₁₀ (100 - % serapan)

atau

A= 2- log₁₀ (% transmitan)

    Pembacaan alat dengan pengukur meter, pencacah digital, perekam atau printer, tergantung dari jenis alat yang digunakan. Alat cahaya tunggal atau cahaya ganda yang tersedia dipasaran keduanya dapat digunakan.

    Pengukuran intensitas fluorosensi dapat dilakukan dengan suatu fluorometer penyaring sederhana. Alat semacam itu terdiri dari sumber radiasi; penyaring primer, bejana uji, penyaring sekunder dan sistem deteksi fluorosensi. Pada jenis fluorometer ini, detektor ditempatkan di atas sebuah sumbu yang membentuk sudut 90° dengan berkas eksitasi. Geometri sudut siku ini memungkinkan radiasi eksitasi menembus contoh uji tanpa mengkontaminasi sinyal luaran yang diterima oleh detektor fluorosensi. Akan tetapi tidak dapat dihindarkan detektor menerima sejumlah radiasi eksitasi sebagai akibat sifat menghamburkan yang ada pada larutan itu sendiri atau adanya debu atau padatan lainnya. Penyaring digunakan untuk menghilangkan sisa hamburan tersebut. Penyaring utama menyeleksi radiasi dengan panjang gelombang pendek yang sanggup mengeksitasi contoh uji, sedangkan penyaring kedua biasanya merupakan suatu penyaring yang lebih halus  sehingga melewatkan fluoresensi dengan panjang gelombang yang lebih panjang tetapi menahan hamburan eksitasi.

    Pada umumnya fluorometer menggunakan tabung-tabung pengganda cahaya sebagai detektor, tersedia banyak tipe dan masing-masing mempunyai sifat khusus yaitu daerah spektra dengan kepekaan maksimum, keuntungan dan derau elektrik. Cahaya yang diteruskan diperkuat dan dibaca pada sebuah meter atau rekorder.

    Spektrofluorometer berbeda dengan fluorometer penyaring, dimana penyaring diganti dengan monokromator dari prisma atau gratting. Untuk penggunaan analitikal, spektrofluorometer lebih unggul dari fluorometer penyaring dalam pemilihan panjang gelombang; fleksibilitas dan kemudahan, dalam hal yang sama spektrofotometer lebih unggul dari  fotometer penyaring.

    Banyak tersedia sumber radiasi, lampu merkuri relatif stabil dan memancarkan energi terutama pada panjang gelombang terpisah. Lampu tungsten memberikan energi terus menerus pada daerah cahaya tampak. Lampu xenon bertekanan tinggi sering digunakan pada spektrofluorometer karena merupakan sumber dengan intensitas tinggi yang dapat mengemisikan energi secara terus-menerus dari ultra violet sampai inframerah.

    Pada spektrofluorometer, monokromator dilengkapi dengan celah. Celah yang sempit menghasilkan resolusi tinggi dan kemurnian spektra, sedangkan celah yang besar mengorbankan hal tersebut untuk kepekaan yang tinggi. Pemilihan ukuran celah berdasarkan pemisahan diantara panjang gelombang eksitasi dan emisi, begitu juga tingkat kepekaan yang dibutuhkan.

    Sel contoh yang digunakan pada pengukuran fluorosensi berupa tabung bulat atau persegi panjang sama seperti pada penggunaan spektrofotometri serapan, kecuali keempat sisi vertikalnya dipoles. Ukuran contoh uji biasanya 2 hingga 3 mL, tetapi beberapa alat dapat menggunakan sel kecil dengan volume 100 hingga 300 mL atau dengan pemegang pipa kapiler yang dapat menampung jumlah lebih kecil contoh uji.

    Alat hamburan cahaya yang tersedia umumnya terdiri dari lampu merkuri, dengan penyaring untuk cahaya hijau atau biru kuat, sebuah alat pengatur paparan cahaya, seperangkat penyaring netral yang sudah diketahui transmitannya, dan pengganda cahaya yang peka yang ditempatkan  pada lengan yang dapat mengitari sel larutan dan dapat diatur pada suatu sudut dari -135° hingga 0° hingga +135° oleh sebuah piringan di luar kotak penyimpanan yang kedap cahaya. Sel larutan bentuknya bermacam-macam, misalnya persegi untuk mengukur hamburan 90°, semioktagonal untuk hamburan 45°,90° dan 135°, dan silindris untuk hamburan pada semua sudut. Oleh karena penetapan bobot molekul memerlukan pengukuran secara tepat perbedaan indeks refraksi diantara larutan dan pelarut [(n-n_o)/C], maka diperlukan alat kedua, sebuah refraktometer diferensial, untuk mengukur perbedaan yang kecil tersebut.

     Spektrometri raman terdiri dari komponen utama sebagai berikut: sumber cahaya radiasi monokromatis (berbagai sinar laser); optik untuk mengumpulkan hamburan cahaya pada contoh uji; monokromator ganda untuk mendispersikan hamburan cahaya dan menghilangkan intensitas kejadian; sistem penguatan dan detektor cahaya yang sesuai. Pengukuran raman sederhana pada sebagian besar contoh uji dengan mengukur titik lebur menggunakan kapiler secara langsung. Karena sumber laser dapat difokuskan secara tepat, hanya membutuhkan beberapa mikroliter contoh uji.

PROSEDUR

SPEKTROFOTOMETRI SERAPAN

    Petunjuk operasional rinci dari spektrofotometer diberikan oleh pabrik. Untuk mendapatkan hasil yang absah, operator harus memahami keterbatasan, sumber kesalahan potensial dan variasi alat. Petunjuk penggunaan untuk pemeliharaan, pembersihan, dan kalibrasi alat serta teknik penanganan sel serapan harus diikuti sesuai petunjuk operasi. Hal-hal berikut ini penting untuk diperhatikan.

    Periksa instrumen untuk ketepatan kalibrasi. Jika digunakan sumber radiasi yang berkesinambungan, harus diperhatikan panjang gelombang dan skala fotometriknya; jika digunakan sumber garis spektra, yang harus diperiksa hanya skala fotometrik. Sejumlah sumber energi radiasi yang mempunyai garis spektra yang sesuai intensitasnya, mempunyai ruang yang cukup pada rentang spektra yang dipilih. Sumber spektra kalibrasi tunggal untuk UV dan cahaya tampak yang terbaik adalah lampu merkuri-kuarsa, menggunakan panjang gelombang 253,7; 302,25; 313,16; 334,15;365,48; 404,66 dan 435,83 nm. Merkuri-kaca juga digunakan diatas 300 nm. Panjang gelombang 486,13 dan 656,28 nm dapat juga digunakan untuk lampu hidrogen. Skala panjang gelombang dapat dikalibrasi dengan kaca penyaring yang sesuai, yang digunakan pada pita serapan daerah UV dan cahaya tampak. Kaca baku yang mengandung didinium (campuran proseodimium dan neodimium) banyak digunakan meskipun kaca yang mengandung holmium lebih baik. Larutan baku holmium oksida telah menggantikan penggunaan kaca holmium. Skala panjang gelombang spektrofotometer IR dekat dan IR diperiksa menggunakan pita serapan dari film polistirena, karbondioksida, uap air atau gas amonia.

    Untuk memeriksa skala fotometrikdapat digunakan, sejumlah penyaring anorganik baku yang sama baiknya dengan larutan baku yang diketahui transmitannya seperti kalium bikromat.

    Pengukuran serapan kuantitatif biasanya menggunakan larutan zat pada sel penahan cairan. Karena pelarut dan jendela sel keduanya menyerap cahaya, harus dilakukan koreksi pada pengukuran serapan. Sel pembanding untuk spektrofotometer UV dan cahaya tampak yang tidak memerlukan sel koreksi tersedia di pasaran. Pada spektrofotometer IR, koreksi untuk perbedaan sel harus dilakukan. Pada beberapa kasus, sepasang sel diisi dengan pelarut yang dipilih dan ditentukan perbedaan serapannya pada panjang gelombang yang dipilih. Sel yang digunakan untuk larutan uji adalah yang menunjukkan serapan lebih besar dan pengukuran serapan harus dikoreksi dengan mengurangkan perbedaan sel.

    Pada FTIR yang terkomputerisasi koreksi tidak diperlukan karena dapat digunakan sel yang sama untuk blangko dan larutan uji. Tetapi, harus dipastikan bahwa transmisi sel konstan.

    Perbandingan contoh uji dengan baku pembanding menggunakan puncak serapan spektra sangat baik untuk zat yang dikehendaki. Penetapan kadar menggunakan spektrofotometri biasanya menggunakan panjang gelombang untuk puncak serapan spektra zat yang diuji. Spektrofotometer yang berbeda menunjukkan perbedaan yang kecil pada puncak panjang gelombang yang nyata. Untuk hasil yang baik membutuhkan pembandingan pada panjang gelombang serapan maksimum. Jika perbedaan lebih dari ± 1 nm dari panjang gelombang yang tertera pada monografi, maka perlu dilakukan rekalibrasi.

Larutan uji

    Untuk penetapan menggunakan spektrofotometer UV atau cahaya tampak, umumnya  contoh uji dilarutkan ke dalam suatu pelarut. Jika tidak dinyatakan lain dalam monografi, penetapan dilakukan pada suhu ruang menggunakan panjang lumen 1 cm. Sebagian besar pelarut sesuai untuk rentang ini, termasuk air, alkohol, kloroform, hidrokarbon rantai pendek, eter dan pelarut asam dan basa kuat. Harus diperhatikan agar pelarut yang digunakan bebas dari kontaminan yang memberikan serapan pada daerah spektra yang digunakan. Biasanya disarankan menggunakan pelarut metanol atau alkohol bebas air, atau alkohol yang didenaturasi dengan penambahan metanol tetapi tidak mengandung benzena atau cemaran pengganggu lainnya. Pelarut dengan kualitas khusus untuk spektrofotometri yang terjamin bebas kontaminasi banyak tersedia dipasaran dari berbagai pabrik. Beberapa pelarut organik kualitas analisa lain mungkin mengandung cemaran dalam jumlah kecil yang mennyerap kuat pada daerah UV. Lot baru dari pelarut ini harus di periksa dan penggunaan lot yang sama pelarut tersebut untuk penyiapan larutan uji dan larutan baku serta blangko harus dilakukan secara hati-hati.

    Tidak ada pelarut dengan ketebalan yang cukup transparan secara sempurna pada semua daerah spektra IR dekat dan spektra IR. Karbon tetraklorida (ketebalan 5 mm) praktis transparan hingga 6 mm (1666 cm^-1). Karbon disulfida (ketebalan 1 mm) sesuai sebagai pelarut hingga 40 mm (250 cm^-1) dengan pengecualian pada daerah 4,2 mm sampai 5,0 mm (2381 cm^-1 sampai 2000 cm^-1) dan 5,5mm sampai 7,5 mm (1819 cm^-1 sampai 1333 cm^-1), dimana karbon disulfida mempunyai serapan yang kuat. Pelarut lain mempunyai daerah transparan yang relatif sempit. Untuk spektrofotometri IR, penambahan kualifikasi untuk pelarut yang sesuai adalah harus tidak memberikan pengaruh pada zat, biasanya digunakan natrium klorida sebagai sel. Contoh uji disiapkan dengan mendispersikan serbuk halus zat padat contoh pada minyak mineral atau dengan mencampur homogen sebelumnya dengan garam halida alkali yang telah dikeringkan sebelumnya (biasanya digunakan kalium bromida). Campuran dengan garam halida alkali ditetapkan langsung atau dengan cakram atau pelet transparan dengan cara mengempa campuran pada cetakan. Kondisi pengeringan untuk kalium bromida adalah 105⁰ dengan vakum selama 12 jam, walaupun tersedia kalium bromida yang tidak membutuhkan pengeringan. Mikroskopi inframerah atau dispersi minyak mineral lebih disukai bila ketidakproporsionalan antara halida alkali dan contoh uji. Contoh uji untuk mikroskopi inframerah disiapkan dengan ketipisan yang tepat, dan untuk dispersi dalam minyak mineral zat uji disuspensikan sebagai lapisan tipis. Untuk spektrometri raman, banyak pelarut yang sesuai, dan sel kaca zat uji yang normal (tidak berfluoresensi) dapat digunakan. Daerah spektra IR  elektromagnetik 0,8 sampai 400 mm. Dari 800 sampai 2500 nm (0,8 sampai 2,5 mm) umumnya dianggap sebagai daerah IR dekat, 2,5 sampai 25 mm (4000 sampai 400 cm^-1) pada daerah IR tengah, dan 25 sampai 400 mm umumnya dianggap sebagai daerah IR jauh. Jika tidak dinyatakan lain pada monografi, daerah 3800 sampai 650 cm^-1 (2,6 sampai 15 mm) digunakan untuk memastikan pemenuhan spesifikasi monografi serapan IR.

    Jika nilai panjang gelombang IR diberikan pada masing-masing monografi, huruf s,m,w menunjukkan serapan kuat, serapan sedang dan serapan lemah, sh adalah pundak, bd adalah pita, dan v adalah banyak. Nilai bervariasi dari 0,1 mm atau 10 cm^-1, tergantung pada jenis alat yang digunakan. Polimorfisme memberikan peningkatan variasi pada spektra IR dari sejumlah senyawa dalam bentuk padat.  Pada pengujian dengan serapan IR, jika terdapat perbedaan antara spektra IR dari analit dengan baku, larutkan sejumlah bagian yang sama zat uji dan baku ke dalam sejumlah volume yang sama pelarut yang sesuai, uapkan larutan sampai kering pada wadah yang serupa dengan kondisi yang identik, dan ulangi pengujian menggunakan residu yang diperoleh.

    Spektroskopi IR dekat saat ini sangat disukai karena pengujian yang mudah. Zat uji dianalisis dalam bentuk serbuk atau dengan teknik reflektansi menggunakan sedikit atau tanpa perlakuan. Pemenuhan spesifikasi laboratorium dapat ditentukan dengan membandingkan spektra dengan spektra sebelumnya yang diperoleh dari baku pembanding. Beberapa bahan obat menunjukkan daya serap yang rendah pada daerah spektra ini yang dapat menimbulkan radiasi IR dekat yang berpenetrasi ke dalam zat uji lebih dalam dari pada radiasi ultra violet, cahaya tampak dan IR. Spektrofotometri IR dekat dapat digunakan untuk mengamati modifikasi matriks, dan dengan kalibrasi yang baik dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

    Pada spektrofotometri serapan atom, sifat pelarut dan konsentrasi zat padat harus menjadi pertimbangan khusus. Pelarut yang ideal adalah yang memberi gangguan minimal baik pada serapan maupun emisi dan menghasilkan atom netral pada nyala. Jika terdapat perbedaan yang signifikan antara tegangan permukaan atau viskositas dari larutan uji dan larutan baku, larutan diaspirasi atau diatomisasi pada kecepatan yang berbeda yang menyebabkan perbedaan yang signifikan dari sinyal yang dihasilkan. Konsentrasi asam dari larutan juga berpengaruh pada proses penyerapan. Pelarut yang digunakan pada penyiapan zat uji dan baku harus sama atau sebisa mungkin serupa dan larutan hasil harus dapat dengan mudah diaspirasi melalui tabung zat uji dari pembakar aspirator. Karena zat yang tidak larut dalam larutan memberikan peningkatan gangguan. Kandungan total zat padat yang tidak larut pada semua larutan sedapat mungkin dibawah 2%.

Perhitungan

    Penggunaan spektrofotometri serapan dalam penetapan kadar dan pengujian umum mempersyaratkan penggunaan baku pembanding. Beberapa pengukuran, terutama pada penetapan kadar, rumus yang ada digunakan untuk menghitung hasil yang diinginkan. Bilangan konstanta biasanya termasuk dalam rumus. Penurunan rumus berikut menunjukkan pendekatan logika pada penetapan konstanta yang terdapat pada rumus penetapan kadar yang tertera pada beberapa monografi.

    Hubungan hukum Beer absah untuk larutan baku (S) dan larutan uji (U)

    A_s adalah serapan larutan baku, C_s adalah konsentrasi larutan baku, A_u adalah serapan larutan uji dan C_u adalah konsentrasi larutan uji. Jika C_s dan C_u ditunjukkan dengan unit yang sama dan serapan dari kedua larutan diukur menggunakan sel pembanding mempunyai dimensi yang sama, daya serap, a dan ketebalan sel, b,  sama, maka kedua rumus dapat digabung, untuk menetapkan C_u

    Jumlah contoh uji bentuk padat yang digunakan untuk analisis biasanya dinyatakan dalam mg. Petunjuk pengenceran diberikan pada penetapan kadar dan konsentrasi enceran larutan yang digunakan untuk pengukuran serapan, biasanya dinyatakan dalam mg per mL. Jumlah dalam mg contoh uji dari senyawa obat atau bentuk sediaan padat untuk analisis, mengikuti volume (V_u) dalam L, konsentrasi (C_u) yang didapat dari jumlah zat uji yang terkandung dalam bobot (Wu) dalam mg dari senyawa obat [Catatan Cu dinyatakan dalam mg per mL atau mg per L]

Bentuk rumus yang ditunjukkan pada penetapan kadar dalam monografi zat padat dapat diturunkan dengan mengganti C_u pada rumus (3) ke dalam rumus (4). Pada rangkuman digunakan rumus (4) dengan pertimbangan keperluan konversi beberapa unit untuk mencapai kesamaan pada rumus (5), Lakukan perhitungan faktor konstanta (V_u) hingga diperoleh rumus akhir

    Penurunan yang sama digunakan pada rumus yang tertera pada monografi untuk zat cair yang penetapan kadarnya menggunakan spektrofotometri serapan. Untuk sediaan cair, hasil perhitungan umumnya dinyatakan dalam jumlah mg bahan obat tiap mL sediaan. Jadi perlu untuk memasukkan dalam rumus tambahan persyaratan volume (V) dalam mL larutan uji yang digunakan.

    Penetapan kadar pada daerah sinar tampak biasanya untuk membandingkan kesesuaian serapan Larutan uji dan Larutan baku yang mengandung sejumlah BPFI yang lebih kurang sama. Pada keadaan tertentu, dibolehkan tidak menggunakan baku pembanding. Hal ini dapat dilakukan jika penetapan kadar dengan spektrofotometri digunakan untuk analisa rutin dan tersedia kurva baku, yang dibuat dari BPFI sebelumnya dan jika penetapan kadar memenuhi hukum Beer dalam rentang antara 75% sampai 125% konsentrasi akhir yang digunakan untuk penetapan kadar. Dalam hal ini, serapan yang didapat pada penetapan kadar dapat diinterpolasikan pada kurva baku dan hasil penetapan kadar dihitung dari kurva baku.

    Kurva baku harus selalu dikonfirmasi secara teratur, dan dibuat baru pada penggunaan spektrofotometer baru atau pereaksi dengan lot baru.

    Penetapan kadar secara spektrofotometri lebih baik dilakukan dengan penyiapan langsung dan menggunakan kurva baku. Jika penetapan kadar dilakukan tidak rutin, jangan gunakan kurva baku tetapi menggunakan perbandingan langsung  dengan baku pembanding yang jumlahnya lebih kurang sama dengan zat uji dan diperlakukan sama.

SPEKTROFOTOMETRI FLUORESENSI

    Pengukuran dengan fluoresensi merupakan teknik analisis yang berguna. Fluoresensi adalah emisi cahaya dari senyawa dalam keadaan tereksitasi yang dicapai dengan menyerap energi radiasi. Senyawa tersebut disebut fluoresen jika dapat berfluoresensi. Beberapa senyawa dapat ditetapkan dengan prosedur fluoresensi inheren atau dengan membuat derivat fluoresensi yang sesuai.

    Contoh uji yang disiapkan untuk spektrofotometri fluoresensi biasanya mempunyai konsentrasi 1 per 10 sampai 1 per 100 dari yang digunakan pada spektrofotometri serapan, dengan alasan berikut. Pada penggunaan analitik, sebaiknya fluoresensi berbanding lurus dengan konsentrasi, tetapi jika konsentrasi contoh terlalu pekat, bagian yang signifikan pada cahaya yang datang diserap oleh zat uji dekat permukaan sel, dan  cahaya yang menuju pusat dapat tereduksi. Pada kondisi ini, contoh dapat bertindak sebagai penyaring. Spektrofotometri fluoresensi merupakan teknik dengan sensitifitas tinggi, dan konsentrasi yang sering digunakan antara 10^-5 sampai 10^-7 M. Jika perlu buat kurva kerja antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi dalam hubungan yang linier. Lakukan koreksi  menggunakan larutan blangko pada semua pengukuran.

    Pengukuran fluoresensi sensitif terhadap debu dan partikel padat lain pada contoh uji. Beberapa pengotor mengurangi intensitas eksitasi dan memberikan kesalahan pembacaan yang lebih tinggi karena terjadi refleksi ganda pada sel contoh uji. Partikel padat dapat dihilangkan dengan sentrifugasi, dapat juga digunakan penyaringan tapi beberapa kertas saring mengandung pengotor berfluoresensi.

    Pengaturan suhu sering menjadi penting pada spektrofotometri fluoresensi. Untuk beberapa senyawa, efisiensi fluoresensi dapat berkurang 1% sampai 2% tiap derajat peningkatan suhu. Pada beberapa kasus, jika presisi maksimum diinginkan, diperlukan pengendalian suhu pada sel contoh. Untuk analisis rutin, cukup dengan membuat pengukuran yang cukup cepat sehingga contoh uji tidak mengalami peningkatan suhu karena paparan sumber cahaya. Beberapa senyawa fluoresensi sensitif terhadap cahaya. Paparan pada fluorometer, menyebabkan senyawa tersebut mengalami degradasi menjadi produk yang lebih  atau kurang befluoresensi. Efek tersebut dapat dideteksi dengan mengamati respons detektor berhubungan dengan waktu, dan dapat dikurangi dengan atenuasi sumber cahaya dengan penyaring atau tabir.

    Perubahan pelarut dapat dengan jelas mempengaruhi intensitas dan distribusi spektra fluoresensi. Tidak dianjurkan untuk mengganti spesifikasi pelarut yang telah ditetapkan pada metoda tanpa penelitian pendahuluan. Beberapa senyawa berfluoresensi dalam pelarut organik tetapi tidak berfluoresensi dalam air. Beberapa pelarut harus dicoba untuk mengetahui senyawa berfluoresensi atau tidak dalam pelarut tersebut sebelum diputuskan untuk digunakan. Pada beberapa pelarut organik, intensitas fluoresensi meningkat dengan berkurangnya oksigen terlarut, yang mempunyai efek pemadaman yang kuat. Oksigen dihilangkan dengan mengalirkan gas iner seperti nitrogen atau helium pada contoh uji.

    Perbandingan intensitas fluoresensi contoh uji dengan intensitas fluoresensi zat baku yang diperoleh pada pengaturan alat yang sama memberikan ukuran semikuantitatif bagi kekuatan fluoresensi. Sering kali sebagai baku pembanding digunakan larutan kuinin dalam asam sulfat 0,1 N atau fluoresein dalam natrium hidroksida 0,1 N dengan kadar tertentu.

HAMBURAN CAHAYA

    Kekeruhan dapat diukur dengan fotometer penyaring fotoelektrik standar atau spektrofotometer, lebih disukai dengan iluminasi di daerah biru dari spektrum. Pengukuran Nefelometer memerlukan alat dengan fotosel yang ditempatkan sedemikian hingga dapat menerima cahaya yang dihamburkan, bukan cahaya yang ditransmisikan; geometri ini juga digunakan dalam fluorometer, sehingga pada umumnya dengan memilih penyaring yang sesuai, fluorometer dapat dipakai sebagai nefelometer.

    Turbidimetri perbandingan mengkombinasikan teknologi Nefelometri 90° dan Turbidimetri; yang berisi fotosel yang menerima dan mengukur hamburan cahaya pada sudut 90° dari contoh dan juga menerima dan mengukur hamburan cahaya yang diteruskan di depan contoh; juga mengukur cahaya yang ditransmisikan secara langsung melalui contoh.

    Linieritas dicapai dengan menghitung perbandingan pengukuran hamburan cahaya sudut 90° terhadap jumlah pengukuran hamburan cahaya sebelumnya dan pengukuran cahaya yang ditransmisikan.

    Keuntungan menggunakan sistem Turbidimetri perbandingan adalah pengukuran cahaya yang menyimpang dapat diabaikan.

    Dalam praktek, disarankan agar dipastikan bahwa terjadinya pengendapan partikel yang diukur dapat diabaikan. Hal ini biasanya dilakukan dengan memasukkan suatu koloida pelindung ke dalam medium cairan suspensi. Hasil diintepretasikan dengan cara membandingkan pembacaan tersebut dengan pembacaan yang diperoleh pada kondisi yang tepat sama dari bahan tersuspensi yang diketahui kadarnya.

    Turbidimetri atau Nefelometri dapat digunakan untuk mengukur endapan yang terbentuk karena interaksi larutan pereaksi yang sangat encer atau bahan partikulat lainnya, seperti suspensi sel bakteri. Untuk memperoleh hasil yang konsisten, semua variabel harus dikontrol dengan teliti. Apabila kontrol semacam itu dimungkinkan, suspensi yang sangat encer dapat diukur.

    Contoh terlarut dilarutkan dalam pelarut pada berbagai kadar yang berbeda yang diketahui dengan tepat, pilihan kadar tergantung pada bobot molekul dari zat terlarut dan berkisar dari 1% untuk bobot molekul = 10.000 hingga 0,01% untuk bobot molekul = 1.000.000. Setiap larutan harus dibersihkan dengan sangat teliti sebelum pengukuran dengan cara penyaringan berulang-ulang melalui penyaring yang halus. Sebuah partikel debu dalam larutan melemahkan intensitas cahaya terhambur yang diukur. Kriteria untuk larutan yang jernih adalah telah dicapai minimum perbandingan intensitas hamburan pada 45°/135°.

    Kekeruhan dan indeks refraksi larutan dapat diukur. Dari persamaan umum hamburan cahaya 90° dibuat grafik HC/t terhadap C dan diekstrapolasikan sampai pengenceran tak terhingga dan bobot molekul rata-rata, M, dihitung dari titik perpotongan 1/M.

PERBANDINGAN VISUAL

    Jika warna atau kekeruhan dibandingkan secara langsung, tabung pembanding warna yang digunakan, diameter dalam dan semua bahan yang digunakan harus sesuai. Untuk pembanding warna, tabung harus dapat dilihat dari bagian atas pada latar belakang putih dengan sumber cahaya berasal dari dasar tabung. Untuk pembanding kekeruhan, tabung harus dapat dilihat secara horisontal dengan latar belakang gelap dan sumber cahaya langsung dari sisi tabung.

    Pada penetapan uji batas yang menggunakan pembanding warna dalam dua wadah yang serupa (misal tabung pembanding – padanan warna), dapat digunakan alat yang sesuai dari pada mata telanjang.