METODE KROMATOGRAFI

       Prosedur kromatografi cair kinerja tinggi berikut adalah digunakan untuk penetapan Vitamin D sebagai kolekalsiferol atau sebagai ergokalsiferol, yang merupakan salah satu kandungan sediaan multi vitamin.

       Selama penetapan, lindungi larutan yang mengandung atau yang diperoleh dari bahan uji, dan Baku Pembanding terhadap udara dan cahaya. Sebaiknya menggunakan lapisan gas inert dan alat gelas  rendah aktinik.

    Baku pembanding [Catatan Gunakan Ergokalsiferol BPFI atau Kolekalsiferol BPFI untuk penetapan kadar sediaan farmasi yang pada etiket mengandung vitamin D sebagai ergokalsiferol atau kolekalsiferol]. Kolekalsiferol BPFI; ?4,6-Kolestadienol BPFI; Ergokalsiferol BPFI; Vitamin D BPFI untuk Kesesuaian Sistem pada Penetapan Kadar. Simpan ditempat yang dingin, terlindung cahaya. Biarkan mencapai suhu kamar sebelum ampul dibuka. Gunakan zat segera, dan buang sisa yang tidak terpakai.

    Pereaksi dan larutan khusus

     Eter Gunakan etil eter P. Gunakan dalam waktu 24 jam setelah wadah dibuka.

     Heksan dehidrat Siapkan kolom kromatografi dengan mengisi tabung kromatografi berukuran 60 cm

x 8 cm dengan 500 g tanah silika untuk kromatografi, ukuran 50 µm hingga 250 µm, yang diaktifkan dengan pengeringan pada suhu 150⁰ selama 4 jam seperti tertera pada Kromatografi adsorpsi kolom dalam Kromatografi <931>. Tuangkan 500 mL heksan P melalui kolom, dan kumpulkan eluat dalam labu bertutup kaca.

     Larutan hidroksitoluen terbutilasi Larutkan sejumlah hidroksitoluen terbutilasi dalam heksan untuk kromatografi hingga kadar 10 mg per mL.

    Larutan kalium hidroksida dalam air Larutkan 500 mg kalium hidroksida P dalam 500 mL air yang baru dididihkan, campur dan dinginkan. Buat larutan ini segar setiap hari.

    Larutan kalium hidroksida etanol Larutkan 3 g kalium hidroksida P dalam 50 mL air yang baru dididihkan, tambahkan 10 mL etanol P, encerkan dengan air yang baru dididihkan hingga 100 mL, campur. Buat larutan ini segar setiap hari.

     Larutan natrium askorbat Larutkan 3,5 g asam askorbat P dalam 20 mL natrium hidroksida 1 N. Buat larutan ini segar setiap hari.

    Larutan natrium sulfida Larutkan 12 g natrium sulfida P dalam 20 mL air, encerkan dengan gliserin P hingga 100 mL.

     Fase gerak A Buat campuran asetonitril P- metanol P – air (25:25:1). Jumlah air dan laju aliran dapat diubah-ubah agar memenuhi persyaratan Kesesuaian sistem.

    Fase gerak B Buat campuran n-amil alkohol P dalam heksan dehidrat P (3 dalam 1000). Perbandingan komponen dan laju aliran dapat diubah-ubah agar memenuhi persyaratan Kesesuaian sistem.

   Larutan baku internal Timbang saksama 15 mg ?4,6-Kolestadienol BPFI, masukkan ke dalam labu tentukur 200-mL, tambahkan campuran toluen P dan Fase gerak B (1 dalam 10) sampai tanda.

    Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 25 mg Ergokalsiferol BPFI atau Kolekalsiferol BPFI, masukkan ke dalam labu tentukur 50-mL, larutkan dalam toluen P tanpa pemanasan,  tambahkan toluen P sampai tanda. Pipet 10 mL larutan persediaan ini ke dalam labu tentukur 100-mL, encerkan dengan toluen P sampai tanda. Buat larutan persediaan segar setiap hari.

    Penetapan Kadar

    Untuk larutan mengandung minyak Timbang saksama sejumlah zat, sebaiknya lebih dari 500 mg dan setara dengan lebih kurang 125 µg kolekalsiferol atau ergokalsiferol (5000 unit FI). Tambahkan 1 mL Larutan natrium askorbat, 25 mL etanol P, dan 2 mL Larutan kalium hidroksida dalam air, campur.

    Untuk kapsul atau tablet Refluks tidak kurang dari 10 kapsul atau tablet dengan campuran 10 mL Larutan natrium askorbat dan 2 tetes Larutan natrium sulfida di atas tangas uap selama 10 menit, hancurkan setiap padatan yang tertinggal dengan batang pengaduk kaca tumpul, dan lanjutkan pemanasan selama 5 menit. Dinginkan, tambahkan 25 mL etanol P dan 3 mL Larutan kalium hidroksida dalam air, dan campur.

    Untuk sediaan kering dan dispersi dalam air Timbang saksama sejumlah zat, sebaiknya lebih dari 500 mg dan setara dengan lebih kurang 125 µg kolekalsiferol atau ergokalsiferol (5000 unit FI). Tambahkan sedikit demi sedikit, sambil digoyang perlahan, 25 mL etanol P, 5 mL Larutan natrium askorbat dan 3 mL Larutan kalium hidroksida dalam air, dan campur.

    Penyabunan dan ekstraksi Refluks sejumlah zat di atas tangas uap selama 30 menit. Dinginkan segera di bawah air mengalir, dan pindahkan campuran yang sudah tersabunkan ke dalam corong pisah, bilas labu penyabunan dua kali, tiap kali dengan 15 mL air, 10 mL etanol P dan dua kali, tiap kali dengan 50 mL eter P. Kocok kuat campuran yang sudah tersabunkan dan bilas selama 30 detik, diamkan sampai kedua lapisan jernih. Pindahkan lapisan air ke dalam corong pisah kedua, tambahkan campuran 10 mL etanol P dan 50 mL heksan P, kocok kuat. Biarkan memisah, pindahkan fase air ke dalam corong pisah ketiga, dan pindahkan fase heksan ke corong pisah pertama, bilas corong pisah kedua 2 kali, tiap kali dengan 10 mL heksan P, tambahkan bilasan ke corong pisah pertama. Kocok fase air dalam corong pisah ketiga dengan 50 mL heksan P dan tambahkan fase heksan ke corong pisah pertama. Cuci gabungan ekstrak eter-heksan dengan mengocok kuat tiga kali, tiap kali dengan Larutan kalium hidroksida etanol, cuci secara kuat dengan 50 mL air sampai pencucian  terakhir netral terhadap fenolftalein P. Tiriskan sisa tetesan air dari gabungan ekstrak eter-heksan, masukkan 2 lembar kertas saring 9 cm dalam bentuk pita-pita ke dalam corong pisah dan kocok. Pindahkan ekstrak eter-heksan yang sudah dicuci ke dalam labu alas bundar, bilas corong pisah dan kertas dengan heksan P. Gabungkan bilasan heksan dengan ekstrak eter-heksan, tambahkan 5,0 mL Larutan baku internal dan 100 µl Larutan hidroksitoluen terbutilasi dan campur. Uapkan sampai kering dalam hampa udara dengan menggoyang dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 40⁰. Dinginkan di bawah air mengalir dan tambahkan gas nitrogen secukupnya untuk memulihkan kembali tekanan atmosfir. Segera larutkan residu dalam 5,0 mL campuran asetonitril P- metanol P dengan perbandingan volume yang sama atau dalam sejumlah tertentu campuran asetonitril P - metanol P hingga kadar vitamin D lebih kurang 25 µg per mL, untuk mendapatkan Larutan uji.

    Sistem kromatografi Gunakan kromatografi, yang dioperasikan pada suhu kamar dilengkapi dengan detektor ultra violet pada 254 nm, kolom pembersih baja tahan karat ukuran 30 cm x 4,6 mm, berisi bahan pengisi L7 dan menggunakan Fase gerak A dan kolom analitik baja tahan karat ukuran 25 cm x 4,6 mm, berisi bahan pengisi L3 dan menggunakan Fase gerak B.

    Uji kesesuaian sistem kolom pembersih Pipet 5 mL Larutan baku ke dalam labu alas bulat yang dilengkapi  dengan pendingin refluks, tambahkan 2 atau 3 butir hablur hidroksitoluen terbutilasi. Alirkan gas nitrogen dan panaskan di atas tangas air pada suhu 90⁰ dalam cahaya redup dan di bawah atmosfir nitrogen selama 45 menit, untuk mendapatkan larutan yang mengandung vitamin D dan pre-vitamin D. Dinginkan, tambahkan 10,0 mL Larutan baku internal, campur, uapkan hingga kering dalam hampa udara dengan menggoyang dalam tangas air pada suhu tidak lebih 40⁰. Dinginkan di bawah air mengalir, dan alirkan gas nitrogen secukupnya untuk memulihkan kembali tekanan atmosfir. Segera larutkan residu dalam 10,0 mL campuran asetonitril P dan metanol P dengan perbandingan volume sama, campur. Suntikkan 500µl larutan ini ke dalam kolom pembersih dan rekam kromatogram seperti tertera pada Prosedur. Kromatogram menunjukkan adanya puncak dengan waktu retensi antara 5 menit dan 9 menit, sesuai dengan pemisahan satu puncak tunggal dari campuran vitamin D, pre-vitamin D, dan ?4,6-Kolestadienol dari senyawa lain. Bila perlu, atur kandungan air atau parameter kerja lainnya seperti tertera pada Fase gerak A.

    Uji kesesuaian sistem kolom analitik Masukkan lebih kurang 100 mg Vitamin D BPFI untuk Kesesuaian Sistem pada Penetapan Kadar ke dalam labu tentukur 100-mL, tambahkan campuran toluen P - fase gerak B ( 1dalam 20) sampai tanda, campur. Refluks sejumlah larutan pada suhu 90⁰ selama 45 menit dan dinginkan. Lakukan 5 kali penyuntikan dari larutan ini dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara trans-kolekalsiferol dan pre-kolekalsiferol tidak kurang dari 1,0 dan simpangan baku relatif untuk respons puncak kolekalsiferol tidak lebih dari 2,0%. [Catatan Kromatogram yang diperoleh pada uji ini menunjukkan waktu retensi relatif lebih kurang 0,4 untuk pre-kolekalsiferol; 0,5 untuk trans-kolekalsiferol dan 1,0 untuk kolekalsiferol]

    Kalibrasi

    Faktor respons vitamin D Masukkan 4,0 mL Larutan baku dan 10 ,0 mL Larutan baku internal dalam labu tentukur 100-mL encerkan dengan Fase gerak B sampai tanda, campur untuk mendapatkan Larutan baku kerja. Simpan Larutan baku kerja pada suhu tidak lebih dari 0⁰, simpan bagian yang tak digunakan untuk Prosedur. Suntikkan 200µl Larutan baku kerja ke dalam kolom analitik, ukur respons puncak untuk vitamin D dan ?4,6-Kolestadienol. Waktu retensi relatif untuk ?4,6- Kolestadienol lebih kurang 1,3. Hitung faktor respons, F_D, dengan rumus:

Cs dan C_R berturut-turut adalah kadar vitamin D dan ?4,6-Kolestadienol, dalam µg per mL, dalam Larutan baku kerja; dan Rs adalah perbandingan respons puncak vitamin D terhadap ?4,6-Kolestadienol.

    Faktor respons pre-vitamin D Pipet 4 mL Larutan baku ke dalam labu alas bulat yang dilengkapi  dengan pendingin refluks, tambahkan 2 atau 3 butir hablur hidroksitoluen terbutilasi. Alirkan gas nitrogen P dan panaskan di atas tangas air pada suhu 90⁰ dalam cahaya redup dan di bawah atmosfir nitrogen selama 45 menit, untuk mendapatkan larutan yang mengandung vitamin D dan pre-vitamin D. Dinginkan, pindahkan dengan bantuan Fase gerak B ke labu tentukur 100-mL yang berisi 10,0 mL Larutan baku internal,encerkan dengan Fase gerak B sampai tanda, campur, diperoleh Campuran kerja. Suntikkan 200µl Campuran kerja ini ke dalam kolom analitik, dan ukur respons puncak untuk vitamin D, pre-vitamin D dan ?4,6-Kolestadienol. Hitung kadar (Cs) vitamin D, dalam µg per mL, dalam Campuran kerja (dipanaskan) dengan rumus:

                                     F_D C_RR’s

C_R  adalah kadar ?4,6-Kolestadienol, dalam µg per mL, dan R’s adalah perbandingan respons puncak vitamin D terhadap ?4,6-Kolestadienol. Hitung kadar (C’_PRE)  pre-vitamin D, dalam µg per mL, dalam Campuran kerja dengan rumus:

                           C’_PRE = Cs – C’s

Hitung faktor respons pre-vitamin D, F_PRE, dengan rumus:

                   ( F_DR’s C’_PRE)/(R’_PRE C’s)

R’_PRE  adalah perbandingan respons puncak pre-vitamin D terhadap ?4,6-Kolestadienol. [Catatan Nilai F_PRE ditetapkan dua kali pada hari yang berlainan, dapat digunakan untuk seluruh prosedur].

    Prosedur Suntikkan 500µl Larutan uji ke dalam kolom pembersih, dan tampung dalam labu alas bulat fraksi yang keluar pada 0,7 hingga 1,3 relatif terhadap waktu retensi puncak campuran vitamin D seperti tertera pada Uji kesesuaian sistem kolom pembersih.Tambahkan 50µl Larutan hidroksitoluena terbutilasi, campur dan uapkan dalam hampa udara sampai kering dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 40⁰ sambil digoyang. Dinginkan di bawah air mengalir dan alirkan gas nitrogen secukupnya untuk memulihkan kembali tekanan atmosfir. Segera larutkan residu dalam 5,0 mL campuran toluena P- metanol P (1 dalam 20). Suntikkan 200µl larutan ini ke dalam kolom analitik, dan ukur respons vitamin D, pre- vitamin D, dan ?4,6-Kolestadienol. Hitung kadar kolekalsiferol (C₂₇H₄₄O) atau ergokalsiferol (C₂₈H₄₄O), dalam µg per mL, dalam Larutan uji dengan rumus:

                      (R”_DF_D + R”_PRE F_PRE)C”_R

R”_D adalah perbandingan respons puncak vitamin D terhadap ?4,6-Kolestadienol; R”_PRE adalah perbandingan respons puncak pre-vitamin D terhadap ?4,6-Kolestadienol; C”_R adalah kadar ?4,6-Kolestadienol, dalam µg per mL Larutan uji.

                          METODE KIMIA

    Prosedur berikut ini digunakan untuk penetapan vitamin D sebagai suatu kandungan  dalam sediaan Farmakope.

    Lakukan penetapan dengan cepat, selama percobaan dilakukan harus diusahakan agar paparan udara dan cahaya aktinik serendah mungkin, sebaiknya menggunakan lapisan gas inert dan peralatan gelas rendah aktinik.

    Baku pembanding [Catatan Gunakan Ergokalsiferol BPFI atau Kolekalsiferol BPFI untuk penetapan kadar sediaan farmasi yang pada etiket mengandung vitamin D sebagai ergokalsiferol atau kolekalsiferol].  Kolekalsiferol BPFI; Ergokalsiferol BPFI.

    Pereaksi dan larutan khusus

    Tanah Fuller untuk kromatografi Gunakan tanah fuller untuk kromatografi yang mempunyai kandungan air dengan susut pengeringan antara 8,5% dan 9,0%.

    Heksan P Gunakan heksan P seperti tertera pada Pereaksi, Indikator dan Larutan, bila perlu didestilasi kembali agar memenuhi persyaratan tambahan berikut ini: Kemurnian spektral Ukur dalam kuvet 1-cm secara spektrofotometri pada 300 nm terhadap udara sebagai blangko; serapan tidak lebih dari 0,070.

    Etilen diklorida Murnikan melalui kolom granul silika gel (20 mesh hingga 200 mesh).

   Larutan kalium hidroksida Larutkan 500 g kalium hidroksida P dalam air hingga 1000 mL.

    Larutan hidroksi toluen terbutilasi Larutkan 10 mg hidroksitoluen terbutilasi P dalam 100 mL etanol P. Buat larutan ini segar setiap hari.

    Eter Gunakan eter yang baru didestilasi, buang 10% destilat awal dan destilat akhir.

    Pereaksi warna Buat 2 larutan persediaan sebagai berikut:

    Larutan A Keluarkan tanpa menimbang, seluruh kristal kering antimon triklorida P dari botol yang berisi 113 g zat yang belum pernah dibuka sebelumnya. Masukkan ke dalam labu yang berisi lebih kurang 400 mL Etilen diklorida P. Tambahkan lebih kurang 2 g alumina anhidrat P, campur, dan saring melalui kertas saring ke dalam wadah kaca jernih bersumbat kaca dan terkalibrasi pada 500 mL. Encerkan dengan etilen diklorida P sampai tanda, campur: serapan larutan tidak lebih dari 0,070, diukur dalam kuvet 20-mm pada 500 nm menggunakan spektrofotometer terhadap blangko etilen diklorida P.

     Larutan B Campur di dalam lemari asam, 100 mL asetil klorida P dan 400 mL etilen diklorida P. Campur 45 Larutan A mL  dan 5 mL Larutan B untuk mendapatkan Pereaksi warna. Simpan dalam wadah tertutup rapat, dan gunakan dalam 7 hari, buang pereaksi jika terbentuk warna.

    Tabung Kromatografi

    Kolom pertama Susun untuk mendapatkan peralatan kromatografi kolom menurun, sebuah tabung beberdiameter dalam 2,5 cm, panjang lebih kurang 25 cm, dan menyempit menjadi berdiameter 8 mm sepanjang 5 cm pada ujung bawah, masukkan kaca masir berporositas besar atau sumbat kecil wol kaca pada batas penyempitan. Bagian yang menyempit dapat dilengkapi dengan kran plastik inert.

    Kolom kedua Pilih tabung yang terdiri dari tiga bagian: 1. Bagian atas yang melebar, dengan diameter dalam 18 mm dan panjang lebih kurang 14 cm; 2. Bagian tengah dengan diameter dalam 6 mm dan panjang lebih kurang 25 cm, dan 3. Tabung bagian bawah yang menyempit dan runcing untuk pengeluaran dengan panjang lebih kurang 5 cm. Masukkan sumbat kecil wol kaca 1 cm di sebelah atas bagian yang menyempit.

    Kolom kromatografi

    Kolom pertama Pada lebih kurang 125 mL isooktan P pada botol bermulut lebar dan bertutup ulir, tambahkan 25 g tanah silika untuk kromatografi, dan kocok sampai terbentuk massa kental. Tambahkan 10 mL polietilen glikol 600 P tetes demi tetes sambil diaduk kuat. Buka tutup botol, kocok kuat selama 2 menit. Tuang kan lebih kurang setengah bagian massa kental ke dalam tabung kromatografi dan biarkan mengendap oleh gravitasi. Kemudian pasang pompa pengisap dan tambahkan sisa suspensi sedikit demi sedikit, dengan memampatkan setiap kali menggunakan alat penekan. Jika terbentuk permukaan yang padat, hentikan pompa pengisap dan tambahkan 2 mL isooktan P.

    Kolom kedua Isi bagian tengah tabung dengan 3 g tanah fuller untuk kromatografi P yang agak kasar dengan bantuan pompa penghisap berdaya lemah (lebih kurang 125 mm raksa).

    Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 25 mg Baku pembanding, larutkan dalam isooktan P hingga kadar lebih kurang 250µg per mL. Simpan dalam lemari pendingin. Pada saat penetapan, pipet 1 mL larutan ini ke dalam labu tentukur 50- mL, uapkan pelarut dengan aliran nitrogen P, larutkan dan encerkan residu dengan etilen diklorida P sampai tanda.

     Larutan uji Timbang atau ukur saksama sejumlah contoh setara dengan tidak kurang dari 125 µg, tetapi sebaiknya setara dengan lebih kurang 250µg ergokalsiferol (10.000 unit FI). Jika hanya ada sedikit atau tidak ada vitamin A sama sekali dalam contoh, tambahkan lebih kurang 1,5 mg vitamin A asetat (setara dengan 3000 unit FI) untuk memberikan pita pemandu dalam kromatografi berikutnya.

    Untuk kapsul atau tablet, refluks tidak kurang dari  10 buah dalam 10 mL air di atas tangas uap selama lebih kurang 10 menit, hancurkan sisa padatan dengan batang pengaduk kaca dan hangatkan lagi selama 5 menit.

    Tambahkan sejumlah volume Larutan kalium hidroksida sebanyak 2,5 mL untuk setiap gram contoh, tetapi tidak kurang dari total 3,0 mL. Tambahkan 10 mL larutan hidroksi toluen terbutilasi dan 20 mL etanol P. Refluks kuat di atas tangas uap selama 30 menit. Dinginkan, pindahkan campuran yang sudah tersabunkan ke dalam corong pisah, bilas labu penyabunan tiga kali tiap kali dengan 10 mL air kemudian bilas tiga kali tiap kali dengan 50 mL eter P, tambahkan setiap bilasan ke dalam corong pisah. Tambahkan lebih kurang 4 g natrium sulfat dekahidrat P ke dalam corong pisah, dan ekstraksi dengan mengocok selama 2 menit. Jika terbentuk emulsi, ekstraksi tiga kali tiap kali dengan 25 mL eter P. Gabungkan ekstrak eter, jika perlu cuci dengan 50 mL air sambil digoyang lemah. Ulangi pencucian beberapa kali dengan pengocokan lebih kuat, tiap kali menggunakan 50 mL air sampai pencucian terakhir tidak menunjukkan warna merah muda pada penambahan fenolftalein LP. Pindahkan ekstrak eter yang sudah dicuci ke dalam labu tentukur 250-mL, encerkan dengan eter P sampai tanda, campur. Pindahkan seluruh atau sejumlah volume yang diukur saksama yang mengandung 250µg ke dalam gelas piala 400 mL berisi lebih kurang 5 g natrium sulfat anhidrat P. Aduk selama 2 menit, enaptuangkan larutan ke dalam gelas piala kedua. Bilas natrium sulfat tiga kali tiap kali dengan 25 mL eter P, tambahkan tiap bilasan ke bagian utama. Uapkan di atas tangas uap hingga lebih kurang 30 mL, pindahkan konsentrat ke dalam labu penguapan alas bulat. Bilas gelas piala tiga kali tiap kali dengan 10 mL eter P, tambahkan bilasan ke dalam labu.Uapkan sisa pelarut dengan sempurna di atas tangas air pada suhu tidak lebih dari 400 dengan bantuan hampa udara, atau dengan aliran gas nitrogen pada suhu kamar. Larutkan residu dalam sedikit heksan P, pindahkan ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan heksan P sampai tanda, campur untuk mendapatkan Larutan uji.

    Prosedur

    Kromatografi kolom pertama Segera setelah 2 mL isooktan P habis dari permukaan Kolom pertama, pipet 2 mL Larutan uji ke dalam kolom. Setelah meniskus Larutan uji mencapai permukaan kolom, tambahkan 2 mL pertama dari tiga kali 2 mL heksan P, tambahkan tiap bagian berturut-turut sebelum larutan habis masuk ke dalam kolom. Lanjutkan penambahan heksan P 5 mL hingga 10 mL sampai jumlah penambahan adalah 100 mL. Jika perlu, atur laju aliran antara 3 mL dan 6 mL per menit dengan memberikan tekanan lemah pada bagian atas tabung kromatografi.

    Buang 20 mL eluen pertama, tampung sisanya. Amati kolom di bawah cahaya ultra violet pada beberapa interval selama kromatografi berlangsung, dan hentikan aliran jika batas pita yang berfluoresensi yang menunjukkan vitamin A berada lebih kurang 5 mm dari dasar kolom. (Lampu ultra violet harus memberikan radiasi lemah pada daerah 300 nm. Seringkali diperlukan penggunaan celah atau tabir sempit dengan lampu perdagangan untuk mengurangi jumlah radiasi hingga persyaratan minimum untuk mendeteksi vitamin A dalam kolom.)

    Pindahkan eluat ke dalam labu penguapan yang sesuai, uapkan heksan dengan sempurna di bawah hampa udara pada suhu tidak lebih dari 40⁰ atau dengan aliran gas nitrogen pada suhu kamar. Larutkan residu dalam lebih kurang 10 mL heksan P.

    Kromatografi kolom kedua Tambahkan Larutan Heksana pelarut yang diperoleh dari Kromatografi kolom pertama pada Kolom kedua. Bilas labu penguapan dengan total 10 mL heksan P sedikit demi sedikit, dan masukkan setiap bilasan ke dalam kolom kedua, biarkan mengalir melalui kolom dan buang eluat yang keluar. Jika heksan di atas permukaan kolom tersisa lebih kurang 1 mL, tambahkan 75 mL toluen P dan eluasi dengan bantuan pompa pengisap (lebih kurang 125 mm raksa) dan tampung eluat. Uapkan toluen di bawah hampa udara pada suhu tidak lebih dari 40⁰ atau dengan aliran gas nitrogen P pada suhu kamar.

    Larutan uji Larutkan residu yang diperoleh dari Kromatografi kolom kedua dalam sedikit etilen diklorida P, pindahkan ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan etilen diklorida P sampai tanda, campur untuk mendapatkan Larutan uji.

    Pengembangan warna Pipet 1 mL Larutan uji ke dalam masing-masing 3 tabung kolorimeter yang sesuai, berdiameter dalam lebih kurang 20 mm dan diberi tanda 1, 2, 3. Ke dalam tabung 1, pipet 1 mL Larutan baku, ke dalam tabung 2, pipet 1 mL etilen diklorida P, ke dalam tabung 3, pipet 1 mL campuran volume sama anhidrida asetat P dan etilen diklorida P. Pada setiap tabung segera tambahkan 5,0 mL Pereaksi warna, sebaiknya menggunakan pipet otomatis, campur. Setelah 45 detik, yang diukur saksama, penambahan Pereaksi warna, ukur serapan ketiga larutan pada 500 nm dengan spektrofotometer yang sesuai, menggunakan etilen diklorida P sebagai blangko. Dengan cara yang sama, 45 detik setelah pembacaan pertama setiap larutan, ukur serapan larutan dalam tabung 2 dan 3 pada panjang gelombang 550 nm. Beri tanda serapan berturut-turut sebagai A¹₅₀₀, A²₅₀₀, A³₅₀₀, A²₅₅₀, dan A³₅₅₀, superskrip menunjukkan nomor tabung dan subskrip menunjukkan panjang gelombang.

    Perhitungan Hitung jumlah µg vitamin D dalam zat yang digunakan dengan rumus:

C_s adalah kadar vitamin D, dalam µg per mL Larutan baku; C adalah kadar contoh (dalam g, kapsul, tablet, dan lain-lain), dalam tiap mL larutan akhir; Au mempunyai nilai (A²₅₀₀ - A³₅₀₀) – 0,67(A²₅₅₀ - A³₅₅₀) ditetapkan dari serapan yang diamati pada larutan dari Larutan uji., dan As mempunyai nilai A¹₅₀₀ - A²₅₀₀ ditetapkan pada larutan dari Larutan baku.                 

METODE BIOLOGI

    Penetapan vitamin D secara biologi terdiri dari pencatatan dan interpretasi hasil pengamatan pada sekelompok tikus yang dipelihara dengan makanan khusus selama suatu periode tertentu, dimana respons biologi terhadap sediaan, dibandingkan dengan respons terhadap kapsul vitamin D BPFI.

    Baku pembanding Kolekalsiferol BPFI.

    Periode pendahuluan Selama periode pendahuluan pada kehidupan seekor tikus, yang tidak lebih dari 30 hari, dari waktu kelahiran sampai pada hari pertama periode pemberian makanan, kandang tikus diawasi langsung, atau sesuai dengan petunjuk penanggung jawab percobaan. Selama periode pendahuluan, gunakan makanan yang memberikan perkembangan normal tetapi kandungan vitamin D terbatas hingga jika diberikan Makanan rakhitogenik pada periode perlakuan makanan, tikus akan menderita rakhitis. Pada akhir periode pendahuluan, sisihkan setiap tikus yang berbobot kurang dari 44 g atau lebih dari 60 g, atau yang menunjukkan gejala-gejala yang merugikan, penyakit atau abnormalitas anatomi.

    Periode perlakuan makanan Selama periode perlakuan makanan yang berlangsung dari akhir periode pendahuluan sampai hari pertama periode uji, beri setiap tikus dengan Makanan rakhitogenik dan air secukupnya, dan jangan diberi makanan atau tambahan makanan lain.

    Makanan rakhitogenik Makanan rakhitogenik terdiri dari campuran yang sama dari kandungan berikut dengan perbandingan yang ditunjukkan pada tabel berikut.

Makanan rakhitogenik

    Jika suatu analisis secara kimia dari keseluruhan makanan menunjukkan perbandingan Ca : P kurang dari 4:1 atau lebih dari 5:1, maka jumlah kalsium karbonat dapat diubah-ubah untuk membuat perbandingan yang sesuai pada tingkat yang sama dalam rentang ini.

    Pengelompokan tikus untuk periode penetapan uji Kandang dianggap sesuai untuk periode uji, jika masing-masing tikus dalam kandang menunjukkan gejala rakhitis seperti sendi-sendi yang membesar, terhuyung- huyung dengan aneh, langkah cepat rakhitis, dengan catatan periode perlakuan makanan tidak kurang dari 19 hari dan tidak lebih dari 25 hari. Timbulnya rakhitis dapat juga dilihat dari ketebalan metafisis rakhitis jika diperiksa dengan sinar-X atau dengan menggunakan Uji garis (akan dijelaskan di bawah) pada tulang kaki salah seekor tikus dalam masing-masing kandang.

    Catat bobot masing-masing tikus, bagi dalam suatu kelompok dimana setiap tikus diberi makan dosis tertentu Baku pembanding atau contoh yang akan diuji potensi vitamin D nya. Untuk masing-masing contoh uji sediakan satu atau lebih kelompok uji dan tidak kurang dari 2 kelompok baku. Kedua kelompok baku dapat digunakan untuk uji bersama lebih dari satu contoh uji. Dalam interval tidak lebih dari 30 hari, sempurnakan pengelompokkan tikus sesuai dengan desain yang membagi kandang diantara kelompok untuk mencapai keseimbangan yang sempurna.

    Untuk keseimbangan yang sempurna, setiap kandang terwakili sama dalam setiap kelompok, gunakan 7 atau lebih kandang yang berisi tikus yang telah diberi makanan, yang jumlahnya paling sedikit adalah sama banyak dengan kelompok yang ada. Dari suatu kandang tertentu, pilih seekor tikus secara acak pada setiap kelompok di hari yang sama. Jika suatu kandang berisi tikus sebanyak dua kali kelompok yang ada, pilih seri tikus kedua dengan cara yang sama. Satu atau dua kandang terakhir yang dipilih dapat dibagi menjadi kelompok sedemikian sehingga pada awal periode uji bobot badan rata-rata setiap kelompok yang telah sempurna, tidak akan berbeda lebih dari 8 g dari bobot badan rata-rata setiap kelompok lain.

    Dosis uji Pilih dua tingkat dosis Kolekalsiferol BPFI, yang berbeda sedemikian rupa hingga perbandingan dosis yang lebih besar terhadap dosis yang lebih kecil tidak kurang dari 1,5 atau tidak lebih dari 2,5. Pilih satu atau dua tingkat dosis yang didasarkan pada potensi yang diduga tunggal untuk masing-masing zat uji. Tingkat dosis zat uji adalah setara dengan dosis baku atau dosis tengah yang sama dengan akar pangkat dua dari hasil dua tingkat dosis baku.

    Pilih tingkat dosis sedemikian hingga jika diberikan pada tikus rakhitis, tikus ini diharapkan menghasilkan derajat kalsifikasi dalam rentang seperti yang dinyatakan pada uji dari data keberterimaan. Sebelum diberikan, Baku pembanding, dan atau zat uji dapat diencerkan dengan minyak biji kapas dengan syarat tidak lebih dari 0,2 mL yang diberikan pada setiap hari. Simpan larutan minyak dalam botol tertutup baik, terlindung cahaya, pada suhu tidak lebih dari 10⁰, dan gunakan dalam waktu 5 minggu.

    Tetapkan satu kelompok tikus untuk setiap tingkat dosis baku dan dosis satu atau lebih zat uji.

    Periode uji Selama periode uji, yang berlangsung dari akhir periode perlakuan makanan selama interval tetap 7 sampai 10 hari, kurung masing-masing tikus sendiri-sendiri dan berikan Makanan  rakhitogenik dan air secukupnya. Berikan Makanan  rakhitogenik yang dibuat dari zat yang sama kepada semua tikus. Pada hari pertama dan hari ketiga (atau keempat) periode uji, beri setiap tikus setengah dosis total yang ditetapkan.

    Sepanjang periode uji, kondisi lingkungan dipertahankan seseragam mungkin untuk semua tikus dan hindari paparan terhadap radiasi antirakhitik. Pada akhir periode tetap dari 7 hari sampai 10 hari, timbang dan bunuh tikus. Dari tikus-tikus tersebut yang pada akhir periode berbobot tidak kurang dari bobot awal periode uji dan yang sudah menerima dosis yang ditetapkan dalam 24 jam waktu pemberian makan, bedah satu atau lebih tulang kaki untuk pemeriksaan Uji garis.

    Uji garis Ambil ujung proksimal tibia atau ujung distal radius, dan bersihkan dari jaringan yang melekat, dalam setiap satu percobaan menggunakan tulang yang sama dari semua hewan. Dengan pisau bersih tajam, buat potongan longitudinal, median melalui penghubung epifisis dan diafisis pada tempat sama pada setiap tulang. Bilas kedua bagian dalam air murni, celupkan segera dalam larutan perak nitrat P (1 dalam 50) selama 1 menit, dan bilas lagi dalam air murni. Paparkan permukaan potongan tulang dalam air terhadap cahaya matahari atau sumber cahaya aktinik lain hingga daerah yang terkalsifikasi membentuk noda yang jelas tanpa tanda perubahan warna pada daerah yang tidak terkalsifikasi. Prosedur pewarnaan dapat dimodifikasi untuk lebih membedakan antara daerah terkalsifikasi dan daerah tak terkalsifikasi.

    Angka derajat kalsifikasi metafisis rakhitis pada setiap tikus, sesuai dengan skala yang memberikan respons rata-rata dan dapat digambarkan sebagai garis lurus terhadap logaritma dosis.

    Keberterimaan Pengamatan dapat diterima untuk digunakan dalam perhitungan potensi hanya dari kelompok yang menunjukkan kalsifikasi dua pertiganya atau lebih, tetapi tidak kurang dari 7 ekor tikus, paling tidak sama besar seperti tingkat paling bawah dan tidak lebih besar dari tingkat tertinggi. Jika angka rata-rata tingkat dosis tinggi pada kelompok baku tidak lebih besar dari angka rata-rata tingkat dosis rendah pada kelompok baku, maka hasil tidak dapat dipakai dan ulangi pengujian. Jika suatu contoh uji diwakili oleh kelompok uji yang pengukuran potensi vitamin D nya tidak dapat diterima dan angka rata-rata dalam setiap kelompok adalah kurang dari angka rata-rata tingkat dosis rendah pada kelompok baku atau lebih besar dari  angka rata-rata tingkat dosis tinggi pada kelompok baku, maka kandungan vitamin D yang ditetapkan masing-masing adalah kurang dari yang ditunjukkan oleh dosis rendah atau lebih besar dari yang ditunjukkan oleh dosis tinggi Baku pembanding.

    Perhitungan Buat tabel, tabulasikan angka (y), tuliskan setiap kandang dalam suatu baris yang terpisah dan setiap kelompok perlakuan dalam kolom. Hilangkan setiap kelompok yang tidak memenuhi Uji Akseptabilitas. Samakan jumlah pengamatan dalam kelompok yang diterima dengan mengabaikan hasil yang tak sama dalam kelompok pada semua kandang atau dengan cara lain yang sesuai seperti tertera pada Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>. Jumlahkan nilai f untuk masing-masing kelompok perlakuan, dimana f adalah jumlah kandang, dan tandai setiap jumlah sebagai T dengan subkskrip masing-masing 1 dan 2 untuk tingkat dosis rendah dan tinggi. Hitung kemiringan b dari jumlah T₁, yaitu ?T₁ dan jumlah T₂, yaitu ?T₂, untuk baku dan zat uji, yang ditunjukkan pada kedua tingkat dosis, dengan persamaan:

i adalah logaritma dari perbandingan dosis tinggi terhadap dosis rendah dan nilainya sama untuk setiap sediaan, dan h’ adalah jumlah sediaan yang ditunjukkan oleh dua tingkat dosis dan termasuk dalam perhitungan nilai b.

    Hitung logaritma dari potensi relatif setiap zat dengan persamaan:

           Log (potensi relatif) = M’

y_u adalah setiap angka rata-rata zat uji, y_s adalah setiap angka rata-rata Baku pembanding , yang merupakan rata-rata dari masing-masing angka untuk tingkat dosis menengah atau rata-rata dari tingkat dosis tinggi dan rendah dan dimana T_b = ?T₂ – ?T₁ dan T_a adalah seperti yang telah ditetapkan pada Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>. Konversikan setiap M’ yang diamati menjadi antologaritmanya untuk memperoleh potensi relatif zat. Kalikan potensi relatif dengan potensi yang diduga dari minyak uji (dalam satuan unit per g), yang diadopsi dari awal pengujian, untuk memperoleh kandungan vitamin D dalam satuan unit FI per g