Penetapan kuantitatif zink di dalam sediaan insulin diperlukan karena zink merupakan unsur komponen esensial dari kristal zink-insulin. Seperti pada timbal, zink dapat ditetapkan dengan metoda ditizon atau spektrum serapan atom.

Metode Ditizon

    Gunakan semua pereaksi dengan kandungan logam berat serendah mungkin. Jika perlu, destilasi air dan pelarut lain dalam alat kaca borosilikat. Bilas semua alat kaca dengan larutan asam nitrat P hangat (1 dalam 2), kemudian dengan air. Pada penggunaan corong pisah hindarkan pelumas yang larut dalam kloroform.

    Larutan dan pelarut khusus

    Larutan amonium sitrat alkalis Larutkan 50 g amonium sitrat dibasa P dalam air hingga 100 mL. Tambahkan 100 mL amonium hidroksida P. Hilangkan logam berat dengan mengekstraksi larutan beberapa kali, tiap kali menggunakan 20 mL Larutan pengekstraksi ditizon seperti tertera pada Uji Batas Timbal <401> hingga larutan ditizon tetap berwarna hijau jernih, kemudian ekstraksi sisa ditizon dalam larutan sitrat dengan kloroform P.

    Kloroform Destilasi kloroform P dalam alat kaca borosilikat, tampung destilat dalam etanol mutlak P secukupnya hingga setiap 100 mL destilat mengandung 1 mL etanol.

    Larutan ditizon Gunakan Larutan baku ditizon seperti tertera pada Uji Batas Timbal <401> menggunakan kloroform P.

    Larutan baku zink Timbang saksama 625 mg zink oksida P yang telah dipijarkan hingga bobot tetap, larutkan dalam 10 mL asam nitrat P, dan tambahkan air hingga 500,0 mL. Larutan ini mengandung 1,0 mg zink per mL.

    Enceran larutan baku zink Pipet 1 mL Larutan baku zink ke dalam labu tentukur 100-mL, tambahkan 2 tetes asam nitrat P encerkan dengan air sampai tanda. Larutan mengandung 10 µg zink per mL. Gunakan larutan ini tidak lebih dari 2 minggu.

    Larutan asam trikloroasetat Larutkan 100 g asam trikloroasetat P dalam air hingga 1000  mL.

    Prosedur Pipet 1 hingga 5 mL zat uji, masukkan ke dalam tabung sentrifuga 40 mL berskala. Jika perlu, tambahkan asam hidroklorida 0,25 N tetes demi tetes hingga larutan jernih. Tambahkan 5 mL Larutan asam trikloroasetat dan air secukupnya hingga 40,0 mL. Campur dan sentrifus.   

    Ukur saksama sejumlah volume beningan yang mengandung 5 µg hingga 20 µg zink, masukkan ke dalam corong pisah. Tambahkan air hingga lebih kurang 20 mL, tambahkan 1,5 mL Larutan amonium sitrat alkalis dan 35 mL Larutan ditizon. Kocok kuat 100 kali, biarkan lapisan kloroform memisah. Masukkan kapas ke dalam tangkai corong pisah untuk menghilangkan emulsi air. Kumpulkan ekstrak kloroform (buang cairan pertama yang keluar) dalam tabung reaksi, dan ukur serapan pada panjang gelombang serapan maksimum lebih kurang 530 nm terhadap larutan blangko.

    Hitung jumlah zink menggunakan kurva kalibrasi yang diperoleh dari 0,5 mL, 1 mL dan 1,5 mL Enceran larutan baku zink. Jika kandungan zink yang telah diekstraksi dari contoh telah melebihi 15 µg, perlakukan 2,0 mL Enceran larutan baku zink yang telah dikoreksi terhadap blangko yang diperlakukan sama, tetapi tanpa penambahan zink.