Protamine Sulfate

Protamin Sulfat adalah campuran yang dimurnikan dari peptida yang dihasilkan dari sperma atau testis ikan salmon yang sesuai yang mempunyai kekuatan menetralkan heparin. Tiap mg protamin sulfat dapat menetralkan tidak kurang dari 100 unit Heparin FI, dihitung terhadap zat kering. Mengandung Protamin Sulfat tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0%, dihitung terhadap zat kering.

Baku pembanding Heparin Natrium untuk Penetapan Kadar BPFI; tidak boleh dikeringkan, tidak boleh ditimbang, rekonstitusi seluruh isi ampul. Simpan dalam lemari pembeku, bersifat higroskopis. Protamin Sulfat BPFI.

Identifikasi

A.   Waktu retensi puncak utama kromatogram Larutan uji sesuai dengan Larutan baku seperti diperoleh pada Penetapan kadar.

B.   Menunjukan reaksi sulfat seperti tertera pada Uji identifikasi umum <291>

C.   Bioidentitas tiap mg protamin sulfat menetralkan tidak kurang dari 100 unit Heparin BPFI dihitung terhadap zat kering.

    Larutan uji A Timbang saksama sejumlah zat, larutkan dalam air hingga kadar lebih kurang           0,15 mg per mL.

    Larutan uji B Pipet 2 mL Larutan uji A, encerkan dengan air sampai 3,0 mL.

    Larutan uji C Pipet 1 mL Larutan uji A, encerkan dengan air sampai 3,0 mL.

    Titran Rekonstitusi seluruh isi ampul Heparin Natrium untuk Penetapan Kadar BPFI, encerkan dalam air hingga kadar lebih kurang 80-120 unit Heparin FI per mL.

    Prosedur[Catatan Titrasi tiap Larutan uji duplo.] Masukkan sejumlah volume Larutan uji ke dalam sel kolorimeter yang sesuai dan atur untuk pengukuran pada panjang gelombang cahaya tampak yang sesuai. Tambahkan Titran dalam sejumlah volume kecil hingga loncatan serapan yang tajam. Catat volume Titran yang ditambahkan. Lakukan penetapan kadar triplo hingga diperoleh 18 penetapan. Hitung jumlah unit Heparin FI dalam volume titran yang ditambahkan pada titik akhir per mg protamin sulfat. Hitung unit Heparin FI yang dinetralkan per mg protamin sulfat yang digunakan dengan rumus:

V_T adalah volume titran dalam mL yang ditambahkan; C_T adalah kadar titran dalam unit Heparin FI per mL; V_S adalah volume dalam mL Larutan uji; C_S adalah kadar protamin sulfat dalam mg per mL Larutan uji. Hitung potensi protamin sulfat sebagai rata-rata dari 18 penetapan. Hitung tiga simpangan baku untuk hasil yang diperoleh dengan tiap Larutan uji. Hitung tiga simpangan baku untuk hasil yang diperoleh dengan tiap tiga penetapan kadar. Penetapan kadar absah jika masing-masing simpangan baku dari enam simpangan baku tidak lebih dari 5% dari simpangan baku rata-rata.

Susut pengeringan <1121> Tidak lebih dari 5%; lakukan pengeringan pada suhu 105º selama 3 jam.

Endotoksin bakteri <201> Tidak lebih dari 7,0 unit Endotoksin FI per mg.

Uji batas besi <331> Tidak lebih dari 10 bpj.

Metilmerkuri Tidak lebih dari 10 bpj, lakukan penetapan menggunakan prosedur yang telah divalidasi. [Catatan Pengujian metilmerkuri tidak diperlukan jika total merkuri kurang dari batas untuk metilmerkuri.]

Sulfat <361> Tidak kurang dari 16% dan tidak lebih dari 22%, dihitung terhadap zat kering; lakukan penetapan sebagai berikut: Timbang saksama lebih kurang 150 mg zat, masukkan ke dalam labu Erlenmeyer, larutkan dalam 75 mL air, tambahkan 5 mL asam hidroklorida 3 N, panaskan hingga mendidih. Dalam keadaan mendidih tambahkan perlahan-lahan 10 mL barium klorida LP, tutup dan panaskan labu Erlenmeyer di atas tangas uap selama 1 jam. Saring, bilas endapan dengan beberapa bagian air panas, keringkan dan pijarkan hingga bobot tetap. Bobot barium sulfat dikalikan dengan 0,4117 menunjukkan bobot sulfat yang terdapat dalam protamin sulfat yang diuji.

Spektrum serapan Lakukan penetapan seperti tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya <1191>. Ukur serapan ultraviolet larutan zat 1% pada panjang gelombang antara 260 dan 280 nm, menggunakan air sebagai blangko. Perbedaan serapan antara larutan zat dan blangko tidak lebih dari 0,1.

Residu pelarut Memenuhi syarat.

Cemaran organik Tidak kurang dari 92%. Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Larutan A, Larutan B, Fase gerak, Larutan baku, Larutan uji, dan Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada Penetapan kadar.

    Prosedur Lakukan seperti tertera pada Penetapan kadar. Suntikkan sejumlah volume (lebih kurang 100 µL) Larutan uji, rekam kromatogram dan ukur semua respons puncak. Hitung persentase kemurnian protamin sulfat dari empat puncak protamin peptida dengan rumus:

r_U1 adalah respons puncak protamin peptida 1 dari Larutan uji; r_U2 adalah respons puncak protamin peptida 2 dari Larutan uji; r_U3 adalah respons puncak protamin peptida 3 dari Larutan uji; r_U4 adalah respons puncak protamin peptida 4 dari Larutan uji; r_T adalah jumlah total respons puncak dari Larutan uji.

Penetapan kadar  Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

    Larutan A Buat larutan natrium fosfat 0,3 M, atur pH hingga 1,8 dengan penambahan asam fosfat P. Saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm dan awaudarakan sebelum digunakan.

    Larutan B Campuran Larutan A-asetonitril P (93,5:6,5).

    Fase gerak Gunakan variasi campuran              Larutan A dan Larutan B seperti tertera pada Sistem kromatografi.

    Larutan baku Timbang saksama sejumlah Protamin Sulfat BPFI, larutkan dan encerkan dengan asam hidroklorida 0,01 N hingga kadar 0,5 mg per mL.

    Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat, larutkan dan encerkan dengan asam hidroklorida 0,01 N hingga kadar 0,5 mg per mL.

    Sistem kromatografi Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 214 nm dan kolom 4,6 mm x 25 cm berisi bahan pengisi L1, dengan ukuran partikel 5 µm. Pertahankan suhu kolom pada 55°. Laju alir lebih kurang 1 mL per menit. Kromatograf diprogram seperti pada tabel berikut:

Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara protamin peptida 1 dan 2 tidak kurang dari 2,0 dihitung dengan metode tangen. Kromatogram dari Larutan baku harus menunjukan empat puncak utama (urutan eluasi: protamin peptida 1, 2, 3, 4), waktu eluasi protamin peptida 4 tidak kurang dari 15 menit. [Catatan Lihat kromatogram baku yang tersedia dalam sertifikat Protamin Sulfat BPFI.] Simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 2,0% untuk jumlah area integrasi tidak kurang dari enam kali penyuntikan, menggunakan integrasi vertikal ke bawah.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 100 µL) Larutan baku (tidak kurang dari enam penyuntikan) dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram selama 30 menit dan ukur semua respons puncak menggunakan skala penuh sebanding dengan ketinggian puncak terbesar dan menggunakan integrasi vertikal ke bawah. Hitung persentase protamin sulfat, yang digunakan dengan rumus:

r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak Larutan uji dan Larutan baku; C_S adalah kadar Protamin Sulfat BPFI dalam mg per mL Larutan baku; dan C_U  adalah kadar protamin sulfat dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan bobot yang ditimbang.

Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat, dengan penutup bersegel. Simpan pada suhu ruang terkendali antara 2° dan 8°.