Riboflavin 5’-Phosphate Sodium 

Riboflavin 5’-(natrium hidrogen fosfat),dihidrat

Anhidrat [130-40-5]

C₁₇H₂₀N₄NaO₉P.2H₂O                              BM 514,36

C₁₇H₂₀N₄NaO₉P                                       BM 478,33

Riboflavin 5’-Natrium Fosfat mengandung tidak kurang dari 73,0% dan tidak lebih dari 79,0% C₁₇H₂₀N₄O₆, dihitung terhadap zat kering.

Pemerian Serbuk hablur halus; kuning jingga; bau lemah; higroskopik; dalam keadaan kering tidak dipengaruhi cahaya, dalam larutan dipengaruhi cahaya terjadi peruraian cepat.

Kelarutan Agak sukar larut dalam air.

Baku pembanding Riboflavin Fosfat BPFI; lakukan pengeringan dalam tabung pengering hampa udara dengan fosfor pentoksida P pada suhu 100º selama 5 jam. Simpan dalam wadah tertutup rapat, terlindung cahaya. Riboflavin BPFI.

Identifikasi

A.  Larutan 0,01 mg per mL zat dalam air dilihat dengan cahaya transmisi ruang: larutan berwarna kuning pucat kehijauan dan dilihat pada panjang gelombang 366 nm: menunjukkan fluoresensi hijau kekuningan intensif, yang hilang setelah ditambah asam mineral atau alkali.

B.   Pada 500 mg zat tambahkan 10 mL asam nitrat P, uapkan campuran di atas tangas air hingga kering, pijarkan sisa hingga karbon hilang. Larutkan residu dalam 5 mL air, saring; filtrat menunjukkan reaksi Natrium dan Fosfat seperti tertera pada Uji Identifikasi Umum <291>.

Rotasi jenis <1081> Antara +37,0° dan +42,0°, dihitung terhadap zat kering; lakukan penetapan dalam waktu 15 menit menggunakan larutan yang mengandung 15 mg per mL dalam asam hidroklorida5 N.

pH <1071> Antara 5,0 dan 6,5; lakukan penetapan menggunakan larutan 10 mg per mL.

Susut pengeringan <1121> Tidak lebih dari 7,5%; lakukan pengeringan dalam hampa udara di atas  fosfor pentoksida P pada suhu 100° selama 5 jam.

Sisa pemijaran <301> Tidak lebih dari 25,0%.

Fosfat bebas Tidak lebih dari 1% sebagai PO₄; lakukan penetapan sebagai berikut:

    Larutan asam molibdat  Encerkan 25 mL larutan amonium molibdat P 70 mg per mL dengan air hingga 200 mL. Pada larutan ini tambahkan perlahan-lahan 25 mL asam sulfat 7,5 N, campur.

    Larutan besi(II) sulfat Buat larutan segar besi(II) sulfat P 100 mg per mL dalam asam sulfat 0,15 N.

   Larutan baku Buat larutan kalium fosfat monobasa P 44,0 µg per mL.

    Larutan uji Buat larutan riboflavin 5’-natrium fosfat 3 mg per mL.

    Blangko Air

    Prosedur Pipet masing-masing 10,0 mL Larutan baku, Larutan uji dan Blangko masukkan ke dalam labu Erlenmeyer 50 mL yang berbeda, tambahkan 10,0 mL Larutan asam molibdat dan 5,0 mL Larutan besi(II) sulfat ke dalam tiap labu. Ukur serapan larutan pada panjang gelombang maksimum lebih kurang 700 nm, menggunakan Blangko: serapan Larutan uji tidak lebih besar dari Larutan baku.

Riboflavin bebas dan riboflavin difosfat [Catatan Selama penetapan terlindung cahaya dan gunakan peralatan kaca aktinik rendah]. Riboflavin bebas tidak lebih dari 6,0% dan Riboflavin difosfat tidak lebih dari 6,0% sebagai Riboflavin, dihitung terhadap zat kering. Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>.

Fase gerak Buat campuran metanol P dan  kalium fosfat monobasa 0,054 M (15:85), saring dan awaudarakan. Jika perlu lakukan penyesuaian menurut Kesesuaian sistem seperti tertera pada Kromatografi <931>.

Larutan baku Timbang saksama lebih kurang  60 mg Riboflavin BPFI, masukkan ke dalam labu tentukur 250-mL, larutkan hati-hati dalam 1 mL asam hidroklorida P, encerkan dengan air sampai tanda. Pipet sejumlah volume larutan ini, encerkan dengan Fase gerak  hingga kadar 9,6 µg per mL.

    Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat, Larutkan dan encerkan dengan air hingga kadar 2 mg per mL. Pipet sejumlah larutan ini, encerkan dengan Fase gerak hingga kadar 160 µg per mL.

    Larutan kesesuaian sistem Larutkan sejumlah Riboflavin Fosfat BPFI dalam air hingga kadar 2 mg per mL. Encerkan larutan ini dengan Fase gerak hingga kadar 160 µg per mL.

Sistem kromatografi Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor fluorometer, yang diatur pada panjang gelombang eksitasi pada 440 nm dan filter emisi pada 470 nm atau atur pada lebih kurang 530 nm untuk detektor fluoresen yang menggunakan monokromator untuk pemilihan panjang gelombang emisi, dan kolom 3,9 mm x 30 cm berisi bahan pengisi L1. Laju alir lebih kurang 2 mL per menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan kesesuaian sistem, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: Waktu retensi riboflavin 5’-monofosfat lebih kurang 20 sampai 25 menit dan waktu retensi relatif untuk masing-masing senyawa tertera pada Tabel; resolusi, R, antara puncak riboflavin 4’-monofosfat dan riboflavin 5’-monofosfat tidak kurang dari 1,0 dan simpangan baku relatif dari respons riboflavin 5’-monofosfat pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 1,5%.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 100 µL)  Larutan baku dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur respons puncak dari Larutan baku dan Larutan uji, tetapkan puncak yang akan diukur dari kromatogram Larutan uji dengan membandingkan waktu retensi dengan puncak dari kromatogram Larutan kesesuaian sistem. Hitung persentase riboflavin bebas dalam zat yang digunakan dengan rumus:

r_U adalah respons puncak riboflavin bebas dalam Larutan uji; r_S adalah respons puncak riboflavin dalam Larutan baku; C_S adalah kadar Riboflavin BPFI dalam µg per mL Larutan baku dan C_U adalah kadar riboflavin 5’-natrium fosfat dalam µg per mL Larutan uji berdasarkan bobot yang ditimbang. Hitung persentase riboflavin difosfat dalam zat yang digunakan dengan rumus:

r_U adalah jumlah respons puncak 3 riboflavin difosfat dalam Larutan uji; r_S adalah respons puncak riboflavin dalam Larutan baku; C_S adalah kadar Riboflavin BPFI dalam µg per mL Larutan baku dan C_U adalah kadar riboflavin 5’-natrium fosfat dalam µg per mL Larutan uji berdasarkan bobot yang ditimbang.

Lumiflavin Tidak lebih dari 0,025. Lakukan penetapan secara Spektrofotometri seperti yang tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya  <1191>.

    Kloroform bebas etanol Kocok 20 mL kloroform P secara hati-hati dengan 20 mL air selama 3 menit, pisahkan lapisan kloroform dan bilas dua kali, masing-masing dengan 20 mL air. Saring kloroform melalui kertas saring, kemudian kocok selama 5 menit dengan 5 g natrium sulfat anhidrat P, biarkan selama 2 jam, dan dekantasi atau saring kloroform yang jernih.

    Larutan uji Lakukan penetapan menggunakan 35 mg zat, kocok dengan 10 mL kloroform bebas etanol selama 5 menit, saring.

    Blangko Gunakan Kloroform bebas etanol.

    Prosedur Ukur serapan Larutan uji dan Blangko pada panjang gelombang serapan maksimum lebih kurang 440 nm. Koreksi serapan Larutan uji terhadap Blangko.

Penetapan kadar Lakukan penetapan secara Spektrofotometri seperti yang tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya  <1191>. [Catatan Selama penetapan seluruh larutan terlindung dari cahaya aktinik dan gunakan peralatan dari kaca aktinik rendah.]

    Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 35 mg Riboflavin BPFI  masukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL, tambahkan 20 mL piridina P dan 75 mL air, kocok sampai larut. Masukkan larutan ke dalam labu tentukur 1000-mL, encerkan dengan air sampai tanda. Pipet 10 mL larutan ini ke dalam labu tentukur 1000-mL kedua, tambahkan lebih kurang 4 mL asam sulfat 0,1 N agar diperoleh pH larutan antara 5,9 dan 6,1, encerkan dengan air sampai tanda hingga kadar lebih kurang 0,35 µg per mL.

    Larutan uji Timbang saksama lebih kurang 50 mg, masukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL, tambahkan 20 mL piridina P dan 75 mL air, kocok sampai larut. Masukkan larutan ke dalam labu tentukur 1000-mL, encerkan dengan air sampai tanda. Pipet 10 mL larutan ini ke dalam labu tentukur 1000-mL kedua, tambahkan lebih kurang 4 mL asam sulfat 0,1 N agar diperoleh pH larutan antara 5,9 dan 6,1, encerkan dengan air sampai tanda.

    Blangko Lakukan seperti yang tertera pada Larutan uji tanpa zat uji.

    Prosedur  Ukur intensitas fluoresensi maksimum Larutan baku, Larutan uji dan Blangko pada panjang gelombang emisi lebih kurang 530 nm, menggunakan panjang gelombang eksitasi lebih kurang 440 nm. Hitung persentase riboflavin, C₁₇H₂₀N₄O_6, dalam zat yang digunakan dengan rumus:

I_U  dan I_S berturut-turut adalah intensitas fluoresensi  dari Larutan uji dan Larutan baku; C_S adalah kadar Riboflavin BPFI dalam µg per mL Larutan baku dan C_U adalah kadar riboflavin 5’-natrium fosfat dalam µg per mL Larutan uji berdasarkan bobot yang ditimbang.

Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya