Cara kromatografi berikut ini digunakan untuk memastikan identitas zat golongan tetrasiklin seperti doksisiklin, oksitetrasiklin dan tetrasiklin, dan untuk memastikan identitasnya dalam sediaan. Ada dua cara yaitu kromatografi kertas (Metode I) dan kromatografi lapis tipis (Metode II). Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, gunakan Metode I.

    Larutan baku Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, larutkan Baku Pembanding Farmakope Indonesia untuk zat yang akan diidentifikasi dalam pelarut yang sama dan kadar yang sama seperti pada Larutan uji.

    Larutan uji Lakukan seperti yang tertera pada masing-masing monografi.

Metode I

    Dapar pH 3,5 Larutkan 13,4 g asam sitrat anhidrat P dan 16,3 g natrium fosfat dibasa P dalam 1000 mL air, campur.

    Fase gerak Buat campuran segar kloroform P-nitrometan P-piridin P (10:20:3).

    Larutan uji campuran Buat campuran sama banyak Larutan uji dan Larutan baku.

    Kertas kromatografi Buat garis penotolan 2,5 cm dari tepi bawah kertas saring (Whatman nomor 1 atau sejenis) 20 cm x 20 cm. Impregnasi kertas dengan Dapar pH 3,5 dengan cara mencelupkan ke dalam wadah, hilangkan sisa pelarut dengan menekan kertas saring diantara dua kertas penyerap yang tidak berfluoresensi.

    Prosedur Totolkan secara terpisah masing-masing 2 ml Larutan baku, Larutan uji dan Larutan uji campuran dengan jarak 1,5 cm. Diamkan sampai agak kering. Masukkan kertas ke dalam bejana untuk kromatografi menaik, yang telah berisi Fase gerak setinggi 0,6 cm, seperti yang tertera pada Kromatografi <931>. Biarkan fase gerak merambat lebih kurang 10 cm. Angkat kertas dan paparkan dengan dengan uap amonia. Amati kromatogram di bawah cahaya Ultra Violet dengan panjang gelombang 366 nm. Catat bercak utama yang berfluoresensi kuning. Harga R_f bercak utama Larutan uji dan Larutan uji campuran sesuai dengan bercak utama Larutan baku.

Metode II

    Larutan resolusi Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, buat larutan dalam metanol P yang mengandung masing-masing 0,5 mg per mL Klortetrasiklin Hidroklorida BPFI, Doksisiklin Hiklat BPFI, Oksitetrasiklin BPFI dan Tetrasiklin Hidroklorida BPFI.

    Fase gerak Buat campuran asam oksalat 0,5 M, yang telah diatur pH hingga 2,0 dengan penambahan amonium hidroksida P-asetonitril P-metanol P (80:20:20).

    Lempeng kromatografi Gunakan lempeng kromatografi yang dilapisi dengan campuran silika gel teroktilsilanisasi P setebal 0,25 mm, aktifkan lempeng pada suhu 130º selama 20 menit, dinginkan dan gunakan selagi masih hangat.

    Prosedur Lakukan seperti yang tertera pada Kromatografi <931>. Totolkan secara terpisah masing-masing 1 mL Larutan baku, Larutan uji dan Larutan resolusi. Diamkan sampai kering. Masukkan lempeng ke dalam bejana kromatografi, hingga merambat lebih kurang tiga perempat tinggi lempeng. Angkat lempeng, tandai batas rambat, diamkan pada udara kering. Paparkan dengan uap amoniak selama 5 menit, segera amati di bawah cahaya Ultra Violet dengan panjang gelombang 366 nm. Terjadi pemisahan sempurna pada bercak Larutan resolusi dan bercak utama Larutan uji mempunyai R_f, dan intensitas warna yang sama seperti pada Larutan baku.