Elektroforesis adalah metode analisis fisika berdasarkan migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan eletrolit di bawah medan listrik
Mobilitas elektroforetik adalah kecepatan gerak dalam meter per detik partikel bermuatan di bawah pengaruh medan listrik 1 volt per meter dan dinyatakan dalam meter persegi per volt detik. Untuk alasan praktis dinyatakan dalam sentimeter persegi per volt detik. Mobilitas dapat ditetapkan hanya untuk elektrolit tertentu di dalam kondisi percobaan operasional yang tepat
ALAT
Alat untuk elektroforesis, selain elektroforesis gel poliakrilamida, terdiri atas komponen utama sebagai berikut.
1. Sumber tenaga yang sesuai yang dapat menyediakan arus searah dan dilengkapi dengan peralatan untuk menunjukkan dan mengatur tegangan atau arus yang digunakan; sirkuit tambahan dapat digabungkan untuk menstabilkan tegangan.
2. Bejana elektroforesis yang biasanya berbentuk empat persegi panjang dan terbuat dari kaca atau plastik kaku, dengan dua bak ganda yang terpisah, anode dan katode, berisi larutan elektrolit.
Pada satu kompartemen dari tiap bak dicelupkan elektrode, sebagai contoh platina atau grafit, yang dihubungkan dengan sirkuit terisolasi pada terminal yang sesuai dari sumber tenaga membentuk anode dan katode. Permukaan cairan dalam kedua bak dipertahankan sama tinggi untuk mencegah penyedotan. Kontak antara kompartemen dalam dan luar dari tiap-tiap bak ganda dibuat dengan jembatan kertas elektroforesis atau dengan melubangi bagian tengah dengan beberapa lubang atau metode lain yang sesuai. Bejana elektroforesis dilengkapi dengan penutup kedap udara yang dapat mempertahankan kelembaban udara jenuh selama percobaan dan mengurangi penguapan pelarut. Alat pengaman dapat digunakan untuk memutuskan arus jika tutup dibuka. Jika daya listrik yang diukur melebihi 10 W, sebaiknya dinginkan penyangga
3. Alat pembawa penyangga
Elektroforesis bidang Bidang penyangga, sebelumnya dibasahi dengan larutan penghantar yang sama dan dicelupkan masing-masing ujungnya ke dalam kompartemen tiap bak yang tidak berisi elektrode, dilekatkan dengan kuat pada pembawa yang sesuai yang dirancang untuk mencegah difusi elektrolit penghantar, seperti bingkai horisontal, penyangga bentuk V yang terbalik atau permukaan serba sama dengan titik kontak pada jarak antara yang sesuai.
Elekroforesis gel Alat terdiri dari sebuah lempeng kaca (misalnya kaca obyek) dengan suatu lapisan gel yang dilapiskan di atas seluruh permukaan dengan ketebalan serba sama. Hubungan antara gel dan larutan penghantar dipengaruhi dalam berbagai cara tergantung pada tipe dari peralatan yang digunakan. Harus diperhatikan untuk mencegah terjadinya kondensasi uap air atau pengeringan lapisan padat.
4. Alat pengukur atau pendektesi
Peralatan untuk elektroforesis gel poliakrilamida terdiri dari dua wadah dapar terbuat dari bahan yang sesuai seperti poli-(metil metakrilat) yang dipasang vertikal satu di atas lainnya. Tiap wadah dilengkapi dengan elektrode platna. Elektrode dihubungkan dengan sumber tenaga yang memungkinkan pengoperasian pada arus konstan atau pada tegangan konstan. Untuk gel batang, bagian dasar wadah sebelah atas mempunyai beberapa pegangan yang sama jaraknya dari elektrode.
Metode
ELEKTROFORESIS GEL-AGAR
Metode I
Letakkan sebuah bingkai logam atau plastik yang sesuai pada lempeng kaca, lekatkan tepi bagian dalam pada lempeng dengan sejumlah kecil Media A cair, letakkan lempeng di atas permukaan yang datar dan tuang secukupnya Media A cair yang sebelumnya diinokulasi dengan Inokulum organisme uji A 1% sehingga menghasilkan lapisan dengan ketebalan 1,2 mm hingga 1,6 mm. Biarkan media membeku, angkat bingkai dan buat tidak kurang 32 lubang, dengan diameter lebih kurang 1 mm, dalam media dengan cara sedemikian hingga larutan dapat ditempatkan dalam bentuk disain kuadrad Latin atau blok teracak dan mempunyai jarak yang cukup untuk pemisahan komponen.
Masukkan sejumlah 5 µl masing-masing dari 4 larutan yang tertera pada monografi dalam lubang sesuai disain yang dipilih. Pindahkan lempeng yang telah disiapkan ke dalam alat elekroforesis dan masukkan ke dalam tiap bak sejumlah volume sama Media A cair, yakinkan bahwa posisi lempeng datar. Dengan menggunakan sumbu yang terdiri dari lapisan ganda kain jerap tiras yang dibasahi dengan metode A cair hubungkan isi kompartemen yang sesuai dari tiap-tiap bak dengan media pada pada lempeng yang sudah disiapkan; untuk hal yang terakhir ini sumbu harus mencapai 2 cm melewati media padat dan ditekan hati-hati supaya terjadi kontak. Tutup bejana dan berikan tegangan antara elektrode untuk menghasilkan tegangan 15 hingga 20 volt per cm panjang lapisan Media A, sebaiknya menggunakan sumber tegangan yang distabilkan. Selama elektroforesis alirkan air atau cairan pendingin lain yang sesuai melalui lempeng logam untuk mencegah suhu naik di atas 15°. Dalam udara dengan kelembaban tinggi, kondensasi uap air dapat terjadi pada permukaan lapisan Media A jika ventilasi kotak dan pendinginan tidak terkendali dengan baik.
Biarkan elektroforesis berlangsung hingga pemisahan dari zat yang akan ditetapkan telah tercapai . Lepaskan elektrode, angkat lempeng kaca, tutupi dan inkubasi pada suhu 30° hingga 35° selama 18 jam, sambil dijaga jangan sampai lapisan media menjadi kering. Ukur diameter, pada suhu 90° terhadap arah migrasi, dari zone inhibisi yang dihasilkan oleh larutan pembanding dan setiap zone yang sesuai yang dihasilkan oleh zat uji. Hitung hasil presentase dari zat uji.
Metode II
Lakukan Metode I dengan modifikasi sebagai berikut : gunakan masing-masing Media B, Media B cair dan inokulum organisme uji B sebagai ganti Media A, Media A cair dan inokulum organisme uji A.
Berikan tegangan antara elektrode untuk menghasilkan tegangan 25 hingga 30 volt per cm dari panjang lapisan Media B. Biarkan elektroforesis selama 2 jam.
ELEKTROFORESIS GEL-AGAROSE
Gunakan lempeng kaca dengan dimensi yang sesuai yang pada permukaannya melekat erat lapisan del tipis Agarose FE, dengan ketebalan serba sama. Gunakan larutan elektrolit I untuk menyeimbangkan agarose. Totolkan secara terpisah pada gel 2 hingga 3 µl larutan yang disiapkan seperti tertera pada monografi. Tutup bejana, hubungkan elektrode pada sumber tenaga dan biarkan elektroforesis pada arus 1 hingga 2 mA per cm lebar gel pada tegangan 300 volt selama lebih kurang 10 menit. Lepaskan elekrode, angkat lempeng kaca dan warnai gel menggunakan larutan toluidina biru P 0,1%, hilangkan kelebihannya dengan pencucian. Evaluasi gel seperti yang tertera dalam monografi.
ELEKTROFORESIS GEL – AGAROSE PATI
Gunakan lempeng kaca dengan ukuran yang sesuai. Tempatkan sebuah bingkai logam atau plastik pada lempeng kaca, lekatkan tepi bagian dalam pada lempeng dengan sejumlah kecil Media C cair, letakkan lempeng pada suatu permukaan yang datar dan tuangkan secukupnya Media C cair untuk menghasilkan lapisan dengan ketebalan lebih kurang 1 mm. Biarkan media membeku, angkat bingkai dan buat 2 buah lubang dengan diameter 1 mm pada permukaan media. Lubang harus berjarak 5 cm satu sama lainnya dan 5 cm dari salah satu ujung lempeng.
Masukkan kedalam lubang sejumlah 5 µl masing-masing larutan seperti tertera pada monografi, tuangkan ke dalam masing-masing kompartemen bejana sejumlah volume yang cukup Larutan elektrolit II dan letakkan lempeng gel menghadap ke atas, di dalam bejana, pastikan bahwa lempeng datar. Dengan menggunakan sumbu yang terdiri dari dua lapisan kain tiras penjerap dan dibasahi dengan Larutan elektrolit II, hubungkan isi kompartemen yang sesuai dari masing-masing bak dengan media padat pada lempeng yang disiapkan hingga katode dihubungkan pada ujung akhir lempeng yang berlubang; sumbu harus mencapai 2 cm melewati media padat dan ditekan perlahan-lahan hingga terjadi kontak. Tutup bejana dan berikan tegangan 20 volt per cm panjang lapisan media, sebaiknya menggunakan sumber tegangan yang distabilkan. Biarkan elektroforesis berlangsung selama 30 menit, lepaskan elektrode dan angkat lempeng kaca. Gunakan prosedur yang sama seperti tertera diatas, lapisi gel dengan Lapisan Media A cair yang sebelumnya telah di inokulasi dengan inokulum organiseme uji A 1% untuk menghasilkan lapisan dengan ketebalan 1,2 hingga 1,6 mm. Inkubasi pada suhu 30° hingga 35° selama 18 jam dan ukur zone inhibisi yang dihasilkan.
ELEKTROFORESIS SELULOSA ASETAT
Jika tidak dinyatakan lain gunakan Metode I.
Metode I
Isi bak pada alat dengan larutan elektrolit seperti tertera pada monografi. Rendam lembaran selulosa asetat dengan ukuran yang sesuai selama 5 menit dalam larutan yang sama dan tekan lembaran agar kering di antara kertas saring. Totolkan secata terpisah pada lembaran pada titik-titik 1 cm dari ujung anode dengan jarak 2,5 cm satu sama lainnya, 1 µl masing-masing larutan seperti tertera pada monografi. Atur tegangan seperti tertera pada monografi dan lakukan elektroforesis menurut waktu yang telah ditentukan. Tekan lembaran agar kering dan rendam ke dalam larutan yang dibuat sebagai berikut: 1 g kalium heksasianoferat(III) P dalam 50 mL air dan tambahkan 2 mL larutan jenuh besi(III) klorida heksahidrat P. Cuci dengan larutan asam ortofosfat P 5% hingga latar belakang sepucat mungkin dan akhirnya cuci dengan air. Amati elektroforetogram.
Metode II
Isi bak dengan campuran dapar barbital pH 8,6. Jika tidak dinyatakan lain gunakan lembaran selulosa asetat terpisah untuk masing-masing larutan seperti tertera pada monografi dan totolkan 2,5 µl larutan dalam bentuk pita 10 mm, atau jika digunakan lembaran lebih sempit, totolkan 0,25 µl larutan per mm lebar lembaran. Berikan medan listrik yang sesuai hingga pita yang paling cepat bergerak tidak kurang dari 30 mm. Pita dicat dengan larutan hitam naftalena 12B P 0,5% dalam campuran metanol P dan asam asetat 5M (90:10) selama 5 menit, kemudian warna dihilangkan dengan campuran metanol P dan asam asetat 5M (81:19) hingga latar belakang sedapat mungkin transparan. Ukur serapan pita pada 600 nm dengan alat yang mempunyai respons linier di atas rentang tidak kurang dari 0 hingga 3, (seperti tertera pada Spektrofotometri dan Hamburan Cahaya <1191>). Hitung hasil rata-rata dari 3 kali pengukuran pada tiap lembar.
ELEKTROFORESIS KERTAS
Isi bak bejana dengan larutan elektrolit seperti tertera pada monografi.
Totolkan secara terpisah pada titik sepanjang garis penotolan (lebih kurang 13 cm dari salah satu ujung Kertas elektroforesis), 1 cm dari tepi kertas dan dengan jarak penotolan tidak kurang dari 2,5 cm sejumlah volume larutan yang dibuat seperti tertera pada monografi .
Biarkan bercak kering dan kemudian tempatkan ujung kertas yang dekat dengan garis penotolan dalam kompartemen yang sesuai dari bak anode dan ujung lain dalam kompartemen yang sesuai dari bak katode. Basahi kertas menggunakan larutan elektrolit dengan cara yang sesuai (misalnya gunakan sikat, mulai dari ujung hingga tempat garis penotolan). Lembaran tempat contoh ditotolkan tidak boleh dibasahi. Tutup bejana, biarkan larutan elektrolit berfungsi melintasi garis penotolan, jika perlu tutup alat hingga terhindar dari cahaya, hubungkan kabel pada sumber tenaga dan hidupkan arus. Atur tegangan hingga lebih kurang 20 volt per cm kertas antara bak dan lakukan elektroforesis selama waktu yang ditetapkan atau hingga zat pemberi tanda telah menempuh jarak yang ditetapkan, jika perlu di tempat gelap, dengan aliran udara dan amati di bawah lampu ultra violet (254 nm).
ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMIDA
Gel dapat dibuat dalam tabung (gel batang), satu larutan digunakan untuk tiap batang, atau dapat dibuat antara lempeng kaca (gel lempeng), beberapa larutan digunakan untuk tiap lempeng.
Metode I
Buat Campuran gel A pada suhu ruang segera sebelum digunakan. Tuangkan ke dalam tabung kaca bersih 7,5 cm x 0,5 cm yang tertutup bagian dasarnya, hingga jarak sama (lebih kurang 1 cm) dari masing-masing ujung atas. Pada bagian dasar tidak boleh ada gelembung udara yang terperangkap. Tutup campuran gel dalam tabung dengan lapisan air untuk menghilangkan udara dan biarkan memadat. Pembentukan gel umumnya memerlukan waktu lebih kurang 30 menit dan sempurna jika terbentuk batas tajam antara gel dan lapisan air. Hilangkan lapisan air. Isi pencadang bawah dengan Dapar tris-glisina pH 8,3. Pasang tabung, yang tutupnya telah dilepaskan, ke dalam pemegang karet di dalam pencadang atas dan turunkan ke posisi sedemikian hingga bagian dasar tabung terendam dalam larutan dapar dalam pencandang bawah.
Totolkan larutan, yang dibuat seperti tertera pada monografi dan diencerkan dengan volume sama larutan jenuh sukrosa P, satu larutan pada bagian atas dari masing-masing gel. Tuangkan dengan hati-hati Dapar tris-glisina pH 8,3 pada bagian atas larutan hingga seluruh tabung terisi penuh, kemudian tambahkan lagi larutan dapar yang sama pada pencadang atas. Tambahkan 0,2 mL larutan biru bromofenol P. Hubungkan elektrode pada sumber tenaga dan lakukan elektroforesis pada arus tetap 1 mA per tabung selama 30 menit, kemudian naikkan menjadi 3 mA per tabung. Matikan arus jika pita biru bromofenol telah bergerak melalui gel hampir mendekati pencadang bawah. Angkat masing-masing tabung dari alat dan keluarkan gel dengan melepaskannya di bawah air dengan kawat baja tahan karat halus atau dengan menyuntikkan air antara gel dan dinding tabung dengan alat suntik yang dilengkapi jarum halus dan keluarkan dari tabung dengan ujung pipet.
Prosedur pewarnaan Rendam gel dalam hitam naftalena LP dalam tabung uji selama 1 jam, pindahkan ke dalam wadah plastik yang tertutup dengan dinding berlubang dan aduk dalam asam asetat 1 M selama 1 malam untuk menghilangkan kelebihan zat warna. Gel dapat disimpan dalam asam asetat 1 M. Evaluasi gel seperti yang tertera dalam monografi.
Metode II
Lakukan seperti Metode I dengan modifikasi sebagai berikut: gunakan Campuran gel B sebagai ganti Campuran gel A. Tempatkan larutan yang dibuat seperti tertera pada monografi, satu larutan pada bagian atas dari masing-masing gel.
Prosedur pewarnaan Rendam gel dalam larutan asam trikloroasetat P 12,5%. Selama tidak kurang dari 1 jam. Untuk tiap 10 mL larutan asam yang digunakan tambahkan 0,5 mL larutan biru asam 90 P 0,25% dan biarkan selama 1 malam. Masukkan larutan pewarna dan cuci gel dengan tidak kurang dari satu kali penggantian asam asetat 1 M. Setelah dipindahkan dari pencucian simpan gel dalam asam asetat 1 M. Evaluasi seperti tertera pada monografi.
Pereaksi
Agarose FE Gunakan kualitas untuk elektroforesis.
Larutan elektrolit I Campur 50 mL asam asetat glasial P dan 800 mL air, atur pH hingga 3,0 dengan litium hidroksida P dan encerkan dengan air hingga 1000 mL.
Larutan elektrolit II Larutkan 1,015 g kalium fosfat dibasa P dan 340 mg kalium fosfat monobasa P dengan air hingga 1000 mL.
Kertas elektroforesis Kertas saring yang sesuai (Whatman 3 MM atau kualitas yang sama) yang telah dicuci secara kromatografi selama 16 jam dengan campuran aseton P dan air (2:1). Setelah pengeringan, potong kertas menjadi lembaran dengan ukuran yang sesuai.
Campuran gel A Campur air, Larutan A, Larutan B dan larutan amonium persulfat P 0,14% (1:1:2:4). Buat gel segera sebelum digunakan.
Campuran gel B Campur 1 bagian volume larutan A, 2 bagian volume larutan B, urea P secukupnya hingga kadar 8 M (11,5 g untuk volume akhir 24 mL) dan air secukupnya hingga volume total 7 bagian volume. Jika perlu hangatkan hingga suhu tidak lebih dari 40° sampai urea larut. Larutan diawaudarakan dan tambahkan 1 bagian volume larutan amonium persulfat P 0,56%. Buat gel segera sebelum digunakan.
Inokulum organisme uji A Biakkan Bacillus subtilis (NCTC 8236) pada suhu 37° hingga 39° selama 7 hari pada permukaan Media A yang mangan(II) sulfat P 0,001%. Gunakan air steril, cuci pertumbuhan, yang sebagian besar terdiri dari spora, dan encerkan hingga diperoleh suspensi yang sesuai; derajat pengenceran harus ditetapkan berdasarkan percobaan. Suspensi yang sesuai umumnya mengandung antara 107 spora dan 108 spora mer mL. Suspensi dapat disimpan untuk waktu yang lama pada suhu tidak lebih dari 4°.
Inokulum organisme uji B Buat seperti pada Inokulum organisme uji A, tetapi menggunakan Media B sebagai ganti Media A.
Media A
Pepton P 6 g
Digesti pankreatik kasein P 4 g
Ekstrak daging sapi P 1,5 g
Ekstrak ragi P 3 g
D-glukosa monohidrat 1 g
Agar P 15 g
Air secukupnya
hingga 1000 mL
Sterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf. Segera sebelum digunakan atur pH hingga 6,5 dengan penambahan asam hidroklorida 0,1 N.
Media A cair Buat seperti tertera pada Media A menggunakan bahan yang sama tanpa menggunakan agar P.
Media B
Pepton P 3,0 g
Digesti pankreatik kasien P 2,0 g
Ekstrak daging sapi P 750 mg
Ekstrak ragi P 1,5 g
Agar P 10,0 g
Air secukupnya hingga 1000 mL
Sterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf. Segera sebelum digunakan atur pH hingga 6,5 dengan penambahan asam hidroklorida 0,1 N.
Media B cair Buat seperti tertera pada Media B menggunakan isi yang sama tanpa menggunakan agar P.
Media C
Agarosse FE 10 g
Pati terhidrolisa 10 g
Larutan elektrolit II secukupnya hingga 1000 mL
Tambahkan agarose FE dan pati terhidrolisa pada larutan elektrolit dan panaskan dalam uap jenuh pada suhu 121° hingga larut. Pertahankan gel yang dilelehkan pada suhu 50° sampai saat digunakan.
Dapar yang digunakan untuk penotolan
Tris (hidroksimetil) metilamina P 1,5 g
Asam hidroklorida 1 N 12 mL
Urea P 96 g
Air secukupnya hingga 200 mL
Larutan A
Tris (hidroksimetil) metilamina P 36,6 g
N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamina P 0,23 mL
Asam hidroklorida 1 N 48,0 mL
Air secukupnya hingga 100 mL
Larutan B
Akrilamida P 30,0 g
N,N’- metilenbisakrilamida P 735 mg
Air secukupnya hingga 100 mL