Antigen sel darah merah dalam darah dapat ditentukan dengan cara manual atau otomatis. Mengingat antibodi sistem Rh hanya diketemukan dalam darah manusia, yang telah diimunisasi dengan sel darah merah manusia yang mengandung antigen Rh, dengan sengaja atau tidak sengaja, maka dalam penetapan golongan Rh donor adalah penting hanya bergantung pada reaksi sel darah merah.

      Untuk uji manual atau otomatis buat suspensi sel darah merah manusia seperti yang tertera pada Penetapan Golongan Darah ABO Donor <101>, untuk uji manual gunakan suspensi darah yang sesuai yang telah dicegah dari penjendalan dengan penambahan anti koagulan yang sesuai.

      [Catatan  Bila dilakukan uji anti globulin tidak langsung buat suspensi sel darah merah 10%.]

      Uji Antigen D  Campur suspensi sel darah merah dengan IgM, Pereaksi golongan darah anti-D atau dengan IgG, Pereaksi golongan darah anti-D, dengan spesifisitas yang telah ditunjukkan pada uji sel darah merah positif-D (sebaiknya genotipe R₁r) dan sel darah merah negatif-D dan tentukan antigen anti-D jika da dengan cara aglutinasi. Jika digunakan pereaksi IgG, perlu dilakukan peningkatan aglutinasi dengan penambahan enzim proteolitik yang sesuai atau albumin serum sapi atau dengan uji sel darah merah yang telah disensitisasi dengan pereaksi antiglobulin.

      Uji manual Gunakan satu dari beberapa cara berikut. Fenotipe D^u jarang terdeteksi dengan menggunakan IgM pereaksi golongan darah anti D; maka gunakan IgG pereaksi golongan darah anti D, sebaiknya sesuai dengan metode (i) atau (iii) berikut:

      Menggunakan IgM, pereaksi golongan darah anti-D Campur 1 bagian volume pereaksi dengan      1 bagian volume suspensi sel darah merah dalam tabung reaksi. Inkubasi tabung pada suhu 37º selama 1 sampai 2 jam dan ketuk perlahan-lahan hingga endapan sel terdispersi. Amati aglutinasi dalam tabung secara makroskopik.

      Menggunakan IgG, pereaksi golongan darah anti D.

      i. Campur 1 bagian volume pereaksi dengan 1 bagian volume suspensi sel darah merah dalam tabung reaksi dan tambahkan sejumlah volume suspensi sediaan papain teraktivasi yang sesuai 0,5% pada pH 5,4. Inkubasi tabung pada suhu 37º selama 30 menit dan ketuk perlahan-lahan hingga endapan sel tersebar merata. Amati aglutinasi dalam tabung secara makroskopik.

      ii. Campur 1 bagian volume pereaksi dengan 1 bagian volume suspensi sel darah merah dalam tabung reaksi. Inkubasi tabung pada suhu 37º selama 1 jam, kemudian tambahkan 1 bagian volume larutan albumin serum sapi P 30% untuk menggantikan beningan yang kontak dengan endapan sel darah merah, dan jaga agar endapan sel darah merah tidak terganggu. Inkubasi kembali tabung pada suhu 37º selama 30 menit dan tutup perlahan-lahan hingga endapan sel terdispersi. Amati aglutinasi dalam tabung secara makroskopik.

      iii. Lakukan uji antiglobulin tidak langsung dengan membuat suspensi sel darah merah 10% dalam larutan natrium klorida P 0,9% sebagai berikut. Tambahkan 4 bagian volume pereaksi ke dalam 2 bagian volume suspensi sel darah merah. Inkubasi tabung pada suhu 37º selama 45 menit. Buat kontrol positif menggunakan sel darah merah positif-D yang diketahui (sebaiknya genotipe R₁r) dan buat kontrol negatif menggunakan sel negatif-D yang diketahui. Setelah inkubasi, cuci sel uji dan sel kontrol 4 kali dengan larutan natrium klorida P 0,9%, tiap kali buang cairan beningan sesempurna mungkin. Suspensikan kembali sel dalam larutan natrium klorida P 0,9% hingga diperoleh suspensi padatan darah lebih kurang 10%. Campur 1 tetes suspensi ini dengan volume sama pereaksi anti IgG manusia yang sesuai dengan pengenceran yang sesuai pada pelat tetes. Goyang pelat tetes perlahan-lahan, amati reaksi positif berupa aglutinasi yang timbul setelah 5 menit (setelah waktu tersebut, besar kemungkinan terbentuk aglutinasi tidak khas). Dengan cara lain, cuci sel uji dan sel kontrol dengan larutan natrium klorida P 0,9% secara manual atau dengan alat mekanik otomatis, dan kemudian tambahkan sejumlah volume yang sesuai pereaksi anti IgG manusia dengan pengenceran yang sesuai. Setelah disentrifus amati aglutinasi berupa endapan sel darah merah.

      Uji otomatis Lakukan dengan cara seperti yang tertera pada Penetapan Golongan Darah ABO Donor <101>, menggunakan Pereaksi golongan darah Rh yang sesuai sebagai pengganti pereaksi golongan darah ABO.

      Uji Antigen C dan E Darah donor yang diuji dengan cara di atas menunjukkan negatif-D, harus diuji lagi terhadap antigen C dan E. Hanya darah donor yang negatif terhadap ketiga antigen dianggap sebagai negatif Rh (rr). Uji terhadap antigen C dan E dilakukan seperti pada Uji Antigen-D menggunakan pereaksi golongan darah Rh anti-C atau anti-E yang sesuai. Dalam sistem otomatis, contoh darah biasanya diuji terhadap ketiga antigen secara simultan.

      Pereaksi golongan darah Rh Pereaksi golongan darah Rh dipilih atas dasar kesesuaian penggunaan dalam uji manual. Jika pereaksi tersebut akan digunakan dalam uji otomatis, kesesuaian pereaksi harus dikaji dengan melakukan uji otomatis menggunakan sejumlah besar suspensi sel darah merah yang mencakup fenotipe Rh dari berbagai variasi.

      Pereaksi golongan darah anti-D, pereaksi golongan darah anti-D, IgM, mudah digunakan tapi tidak selalu terpercaya. Pereaksi golongan darah anti-D, IgG, lebih banyak tersedia dan lebih umum digunakan.

      Pereaksi golongan darah Rh dibuat dari sera atau plasma didefibrinasi dari satu orang atau lebih yang diimunisasi dengan antigen yang sesuai dari sistem Rh atau dari biakan limfosit mamalia. Hanya bahan yang telah diuji negatif terhadap antigen permukaan Hepatitis B dengan metode peka dapat digunakan. Pereaksi golongan darah Rh dapat berupa cairan atau hasil rekonstitusi pereaksi kering.

      Pereaksi cair jernih atau sedikit opalesen, kekuningan atau cairan tidak berwarna tanpa kekeruhan, dapat mengandung bahan pengawet antimikroba yang sesuai. Pereaksi kering berupa serbuk kuning pucat atau padatan rapuh.

      Pereaksi golongan darah Rh terdiri dari 4 tipe, yaitu pereaksi golongan darah anti-D, IgM; pereaksi golongan darah anti-D, IgG; pereaksi golongan darah Anti-C; dan pereaksi golongan darah anti-E.

      Pereaksi golongan darah anti-D, IgM, mengaglutinasi suspensi sel positif-D dalam larutan natrium klorida P 0,9%. Pereaksi harus tidak menunjukkan aglutinasi dalam kondisi seperti yang tertera pada penggunaan untuk tiap kumpulan sel yang lengkap yang tidak mengandung antigen D dan yang dipilih sebagai antigen sel darah merah dengan rentang luas.

      Pereaksi golongan darah anti-D, IgG, mengaglutinasi sel darah merah manusia positif-D dalam larutan albumin serum sapi P 20% sampai 30%. Pereaksi ini juga melapisi suspensi sel darah merah manusia positif-D dalam larutan natrium klorida P 0,9% hingga sel ini kemungkinan dapat diaglutinasi dengan pereaksi antiglobulin anti-IgG. Dengan modifikasi kimia IgG, pereaksi golongan darah anti-B, IgG, dapat mengaglutinasi suspensi sel darah merah manusia positif-D dalam larutan natrium klorida-P 0,9%. Pereaksi harus tidak menunjukkan aglutinasi atau melapisi, dalam kondisi seperti yang tertera pada penggunaan, untuk tiap kumpulan sel yang lengkap yang tidak mengandung antigen D dan yang dipilih sebagai antigen sel darah merah dengan rentang luas.

      Pereaksi golongan darah anti-C mengandung terutama IgM, atau IgG, antibodi anti-C. Lakukan uji yang sesuai terhadap kelas imunologis antibodi yang ada (masing-masing seperti yang tertera pada pereaksi golongan darah anti-D, IgM, dan pereaksi golongan darah anti-D, IgG).

      Untuk mendeteksi antigen C dalam donor negatif D; anti C, D (yaitu anti-G) dapat digunakan. Aktivitas anti-C harus dapat bereaksi dengan antigen C^w jika dalam kombinasi, C^w/c. Anti-G yang bereaksi dengan antigen C atau D, atau kedua antigen C dan D, jika ada tidak mempengaruhi sediaan yang negatif-DE. Dengan cara lain pereaksi anti-C dapat digunakan, dibuat dari donor negatif-C, positif-D, E.

      Anti-C harus dapat mendeteksi antigen C^w jika dalam kombinasi C^w/c, dan dapat mendeteksi C dalam posisi sis dengan e dan E (Ce, CE). Pereaksi ini kurang dapat bereaksi dengan kompleks CE (CDE, CdE). Pereaksi golongan darah Anti-C tidak boleh menunjukkan aglutinasi, dalam kondisi seperti yang tertera pada penggunaan, untuk tiap kumpulan sel yang lengkap yang tidak mengandung antigen C atau C^w (atau antigen D dalam anti-G) yang dipilih sebagai antigen sel darah merah dengan rentang luas meliputi A, B dan E.

      Pereaksi golongan darah anti-E dapat mengandung terutama IgM atau IgG, antibodi anti-E dan lakukan uji yang sesuai terhadap kelas imunologis antibodi yang ada (masing-masing seperti yang tertera pada pereaksi golongan darah anti-D, IgM, dan pereaksi golongan darah anti-D, IgM, dan pereaksi golongan darah anti-D, IgG).

      Banyak contoh pereaksi anti-E mengandung sejumlah anti-cE, antibodi Rh yang mengaglutinasi hanya sel darah merah manusia dengan antigen c dan E dinyatakan dengan gen c dan E yang terdapat dalam kompleks gen Rh yang sama, yaitu posisi cis, dan yang tidak mengaglutinasi sel yang mengandung antigen E yang dinyatakan dari kompleks gen seperti CDE dan CdE yang tidak mengandung e. Pereaksi golongan darah anti-E harus menunjukkan aglutinasi terhadap sel darah merah harus yang mengandung antigen E yang tidak menunjukkan kompleks gen yang juga mengandung e. Pereaksi tidak boleh menunjukkan aglutinasi, dalam kondisi seperti yang tertera pada penggunaan, tiap kumpulan sel yang lengkap yang dipilih sebagai antigen sel darah merah dengan rentang luas. Kemungkinan lain dapat digunakan pereaksi anti-D, E.

      Pereaksi golongan darah Rh, jika perlu direkonstitusi seperti yang tertera pada etiket, memenuhi persyaratan berikut.

      POTENSI

      Pereaksi golongan darah anti-D, IgM  Mengandung anti-D sebagai aglutinin salin dalam jumlah yang memberikan reaksi positif pada pengenceran 1 dalam 32 terhadap sel darah merah yang diketahui mengandung antigen D.

      Pereaksi golongan darah anti-D, IgG  Potensi pereaksi golongan darah anti-D, IgG, ditetapkan dengan membandingkan aktivitas antibodi aglutinin albumin dengan Serum Golongan Darah BPFI yang sesuai atau dengan baku lain yang sesuai yang telah dibakukan terhadap Serum Golongan Darah BPFI.

      Lakukan penetapan titrasi pereaksi uji bersama dengan sediaan baku terhadap suspensi sel darah manusia yang mengandung antigen D.

      Pereaksi golongan darah anti-D, IgG, mengandung tidak kurang dari 32 unit antibodi anti-D per mL, titer pereaksi yang diuji tidak kurang dari setengah dari titer Serum Golongan Darah Tidak Lengkap Anti-Rh₀ (anti-D) Manusia BPFI (mengandung 32 unit).

      Pereaksi golongan darah anti-C Mengandung antibodi anti-C dalam jumlah tertentu yang dapat memberikan reaksi positif terhadap sel darah merah yang diketahui mengandung antigen C pada pengenceran 1 dalam 8.

      Pereaksi golongan darah anti-E Mengandung antibodi anti-E dalam jumlah tertentu yang dapat memberikan reaksi positif terhadap sel darah merah yang diketahui mengandung antigen E pada pengenceran 1 dalam 8.

      Sterilitas <71> Memenuhi syarat.

      Wadah dan penyimpanan Dalam wadah steril tertutup kedap.

Sediaan dalam bentuk cair yang tidak mengandung pengawet antimikroba disimpan dalam keadaan beku sebaiknya pada suhu di bawah -30º.

      Sediaan bentuk cair yang mengandung pengawet antimikroba disimpan pada suhu 2º hingga 8º, hindari pembekuan kecuali bila pengawet tersebut tidak merusak pereaksi dalam keadaan beku.

                Sediaan kering disimpan pada suhu tidak lebih dari 20º.