PENGHITUNGAN ANGKA SPORA

    Untuk indikator biologi dengan pembawa kertas, lepaskan tiga buah indikator biologi yang relevan dari masing-masing wadahnya. Dispersikan kertas pembawa dengan memasukkan ke dalam 250 mL “blender” steril berisi 100 mL Air Murni dingin, campurkan hingga terbentuk suspensi homogen. Umumnya pencampuran dilakukan selama 15 menit atau lebih untuk memperoleh perolehan kembali yang optimal. Pindahkan sejumlah 10 mL alikuot suspensi ke dalam 16 x 125 mm tabung bertutup ulir steril. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung berisi suspensi dalam tangas air pada 95º – 100º selama 15 menit (syok panas) dimulai setelah suhu mencapai 95º. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung berisi suspensi dalam tangas air pada 80º – 85º selama 10 menit dimulai setelah suhu mencapai 80º. Dinginkan secara cepat dalam tangas air-es pada 0º - 4º. Pindahkan 1 mL alikuot masing-masing ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril, pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30 – 300 koloni, tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap pasangan lempeng dengan perlakuan sebagai berikut ini. Bila indikator biologi mempunyai kadar spora rendah, mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi dan menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk tiap alikuot. Masukkan 1,0 mL suspensi dari tingkat pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing dua cawan Petri 15 – 100 mm. Dalam waktu 20 menit tambahkan pada tiap cawan 20 mL media Soybean-Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45º – 50º. Campur dengan memutar cawan hingga suspensi homogen, dan kemudian dibiarkan memadat. Inkubasikan lempeng dengan posisi dibalik pada 55º – 60º, untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas, dan pada 30º–35º Indikator Biologi Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering dengan Pembawa Kertas atau pada suhu optimal perolehan kembali ditentukan dari pabrik. Amati lempeng setelah 24 dan 48 jam, catat jumlah koloni tiap lempeng; dan gunakan jumlah koloni yang diamati setelah 48 jam untuk menghitung hasil. Hitung jumlah rata-rata spora tiap indikator dari hasil penghitungan, menggunakan faktor pengenceran yang sesuai. Pengujian dinyatakan absah bila log jumlah spora per (kertas) pembawa pada 48 jam sama atau lebih besar dari log jumlah setelah 24 jam dalam tiap wadah. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah, Self-Contained lepaskan  secara aseptik tiga buah pembawa dari masing-masing wadahnya, dan perlakukan langsung seperti pada Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas.

    Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-Kertas, lepaskan secara aseptik tiga buah pembawa dari masing-masing kemasan asli atau wadahnya. Masukkan tiap pembawa ke dalam wadah steril yang sesuai berisi 100 mL Air Murni dingin, dan sonikasi atau kocok dengan pengocok-resiprok secukupnya. Lima belas menit atau lebih mungkin diperlukan untuk perolehan kembali yang optimal. Sebaiknya telah dilakukan studi pendahuluan untuk memastikan bahwa metode perolehan kembali menghasilkan sedikitnya 50%-300% perolehan kembali angka spora hidup. Pindahkan sejumlah 10 mL alikuot suspensi ke dalam 16x125 mm tabung bertutup ulir steril. Panaskan tabung berisi suspensi Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans pada 80º – 85º selama 10 menit. Panaskan tabung berisi suspensi Geobacillus stearothermophilus pada 95º – 100º selama 15 menit. Penghitungan waktu dimulai pada saat tiap rentang suhu pemanasan mencapai yang terendah. Dinginkan segera dalam tangas air es pada 0º - 4º. Pindahkan masing-masing 1 mL alikuot ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril, pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30 – 300 koloni, tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap pasangan lempeng dengan perlakuan sebagai berikut ini.

    Bila indikator biologi mempunyai kadar spora rendah, mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi dan menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk tiap alikuot. Masukkan 1 mL suspensi dari tingkat pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing dua cawan Petri 15–100 mm. Dalam waktu 20 menit tambahkan pada tiap cawan 20 mL media Soybean-Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45° – 50º. Campur dengan memutar cawan hingga suspensi homogen.

    Untuk G.stearothermophilus, B.atrophaeus, B.subtilis, dan B.coagulans, gunakan media Soybean-Casein Digest Agar dan inkubasikan lempeng secara aerob dengan posisi dibalik pada suhu berturut-turut untuk tiap mikroba sebagai berikut: 55º – 60º, 30º – 35º, 48º– 52º, atau pada suhu optimum khusus sesuai dengan indikator biologi pabrik. Amati lempeng setelah 24 dan 48 jam. Catat jumlah koloni tiap lempeng. Hitung rata-rata jumlah spora tiap indikator dari hasil penghitungan, menggunakan faktor pengenceran yang sesuai. Pengujian dinyatakan absah bila log jumlah spora per pembawa pada 48 jam sama atau lebih besar dari log jumlah setelah 24 jam dalam tiap wadah.

    Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair, menggunakan G.stearothermophilus, B.atrophaeus, B.subtilis, dan B.coagulans sebagai indikator biologi, disiapkan seri pengenceran secukupnya, suspensi asli spora dengan Air Murni dingin steril dalam tabung bertutup ulir 16 x 125 mm menggunakan prosedur khusus penghitungan angka spora dengan Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-Kertas.

PENETAPAN NILAI-D

    Lakukan seluruh pengujian seperti dijelaskan dalam bagian ini di bawah kondisi aseptik, menggunakan peralatan steril untuk mikroba non-termofilik. Penetapan Nilai-D untuk G.stearothermophilus dan B.coagulans dapat dilakukan di lingkungan tidak diklasifikasi tetapi terkendali.

Peralatan

    Peralatan uji untuk menetapkan resistensi mikrobiologi yang dijelaskan secara rinci dalam ISO 18472, Sterilisasi Produk Kesehatan-Indikator Biologi dan Kimia-Peralatan Uji. Rincian Resistometer Evaluasi Indikator Biologi (REIB) secara individu bervariasi dengan rancangan spesifik dan proses sterilisasi utama bersama dengan yang digunakan. Tetapkan bahwa kinerja bejana REIB sesuai dengan persyaratan standar ISO untuk paparan indikator biologi, dengan perbedaan rancangan yang dapat diterima.

Prosedur

    Lakukan pengujian Nilai-D pada setiap pengaturan kondisi sterilisasi, paket indikator biologi diberi tanda (label) untuk digunakan. Ambil kelompok spesimen indikator biologi sejumlah yang cukup dalam wadah asli masing-masing, setiap kelompok terdiri dari tidak kurang 5 spesimen. Jumlah kelompok menyediakan rentang pengamatan dari tidak kurang dari satu label nilai-D di bawah tanda waktu bertahan hidup (”survival time”) sampai tidak kurang dari satu label nilai-D di atas tanda waktu mematikan (”kill time”). Letakkan setiap kelompok pada tempat spesimen (“specimen holder”) terpisah yang sesuai yang memungkinkan setiap spesimen terpapar kondisi sterilisasi yang telah ditentukan pada lokasi khusus dalam bejana sterilisasi REIB. Periksa alat REIB untuk parameter pengoperasian menggunakan “specimen holder” tanpa spesimen. Pilih seri tambahan waktu sterilisasi dari waktu terpendek untuk spesimen yang diuji. Perbedaan pada seri waktu sterilisasi, sedapat mungkin konstan dan perbedaan antara waktu yang berdekatan tidak lebih besar dari 75% nilai-D label.

    Prosedur uji penggunaan bejana REIB untuk evaluasi resistensi mikroba ditetapkan dalam standar ISO seri 11138. Indikator biologi sebaiknya mengikuti standar yang sesuai. Metode uji dan penggunaan pembawa dengan REIB mungkin dapat disesuaikan untuk indikator biologi khusus. Metode dan peralatan yang digunakan untuk pembawa kertas dapat berbeda dengan pembawa lain dan secara substansial berbeda dari penggunaan suspensi indikator biologi.

    Kondisi pemaparan nilai-D untuk pembawa bahan alternatif sama dengan kondisi yang digunakan untuk menetapkan nilai-D pembawa kertas. Jika label pabrik membolehkan penggunaan pembawa dengan berbagai metode sterilisasi, maka data nilai-D, ”survival time”, “kill time” disediakan oleh pabrik untuk setiap metode sterilisasi. Hal ini memungkinkan indikator biologi yang diinokulasi pada pembawa selain kertas disterilisasi/ dekontaminasi dengan metoda gas atau uap seperti fase uap hidrogen peroksida dan klorin dioksida.

    Standar kondisi fisik evaluasi indikator biologi untuk penggunaan dengan fase uap hidrogen peroksida dan klorin dioksida belum ditetapkan. Dalam hal klorin dioksida, kadar gas, kelembaban relatif, dan suhu merupakan pengendali kondisi proses yang penting, yang dapat diukur dengan akurat. Pabrik penghasil indikator biologi menggunakan klorin dioksida harus menyatakan kondisi yang harus dilakukan di bawah penetapan nilai-D, sehingga pengguna dapat paling tidak melihat resistensi banyak indikator biologi sebagai pembanding untuk mengantisipasi kondisi yang digunakan. Situasi dengan fase uap hidrogen peroksida lebih kompleks, berbagai peralatan pabrik menawarkan dekontaminasi atau kondisi sterilisasi yang berbeda. Jadi tidak ada proses standar untuk melakukan dekontaminasi dengan fase uap hidrogen peroksida atau sterilisasi permukaan. Hal ini diikuti tidak adanya metode evaluasi standar industri indikator biologi, walaupun mungkin tidak berhubungan langsung antara kadar uap dan kecepatan ataupun keefektivan inaktivasi indikator biologi. Sebagai tambahan, sulit untuk mengases kelembaban relatif secara akurat, yang sering ditetapkan sebagai parameter proses kritis dengan adanya uap hidrogen peroksida. Untuk alasan ini lebih masuk akal untuk menetapkan resistensi indikator biologi menjadi relatif atau ukuran relatif pabrik daripada nilai-D sebenarnya. Selanjutnya tergantung peralatan dan proses yang dikerjakan, dan ini menjadi tidak mungkin bagi pengguna mengulangi uji resistensi biologi yang telah dilakukan oleh pabrik.

    Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair, dilakukan penetapan nilai-D untuk tiap mikroba untuk menyediakan suspensi hasil panen spora cair. Uji dilakukan dengan seri pengenceran berdasarkan status titer spora dari suspensi dengan Air Murni dalam tabung steril.

    Bila suspensi dimasukkan pada atau dalam substrat misal tutup elastomerik atau produk formulasi, resistensinya mungkin berbeda dari yang ditetapkan dalam Air Murni. Perbedaan itu mungkin bermakna untuk penggunaan indikator biologi dan pengukuran yang sesuai sebelumnya untuk digunakan dalam aktivitas validasi sterilisasi.

Perolehan Kembali

    Setelah melengkapi prosedur sterilisasi Indikator Biologi untuk Sterilisasi Panas Kering dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi untuk Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas; atau Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap dengan Pembawa Kertas yang dapat diterapkan dan dalam catatan waktu tidak lebih dari 4 jam, buka secara aseptik dan tambahkan tiap strip ke dalam media sesuai (lihat Media di bawah Uji Sterilitas <71>) untuk merendam indikator biologi dalam tabung yang sesuai. Untuk tiap Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah, Self-Contained spesimen, strip kertas direndam dalam media self-contained menurut petunjuk pabrik, dalam catatan waktu tidak lebih dari 4 jam. Inkubasi tiap tabung pada suhu optimal perolehan kembali yang ditetapkan pabrik. Amati tiap tabung berisi media yang diinokulasi pada interval yang cukup untuk total 7 hari setelah inokulasi. (Bila terjadi pertumbuhan pada saat pengamatan maka inkubasi tidak perlu dilanjutkan). Catat jumlah spesimen yang tidak tumbuh pada tiap waktu.

    Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah, Pemanasan Kering, dan Sterilisasi Gas, Pembawa Bukan kertas, perolehan kembali spora dari pembawa indikator biologi akan mengikuti prosedur yang dijelaskan dalam prosedur Angka Total Spora Hidup. Metode penetapan nilai-D indikator biologi dengan pembawa kertas dapat digunakan untuk menghitung nilai-D untuk pembawa bukan kertas. Kondisi inkubasi mikroba yang akan digunakan untuk indikator biologi dengan pembawa bukan kertas dijelaskan dalam bab Angka Total Spora Hidup.

    Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair, metode perolehan kembali setelah kondisi pemaparan sterilisasi adalah metode yang dijelaskan dalam bab Angka Total Spora Hidup suspensi spora cair, dan jika penetapan nilai-D pemanasan kering dibuat dari suspensi B. atrophaeus, prosedur perolehan kembali sama seperti dijelaskan dalam Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas.

    Ketika digunakan Clostridium sporogenes sebagai indikator biologi, metode persiapan, inokulasi, metode perolehan kembali dan media harus diadaptasikan untuk dapat mengakomodasi penggunaan pembentukan spora anaerob.

Penghitungan

    Penetapan nilai-D indikator biologi dapat dilakukan menggunakan Metode Spearman-Karber Terbatas, Kurva Survival atau prosedur Sumbu-Murphy-Cochran. Lebih baik menggunakan metode sama dengan yang ditetapkan oleh pabrik indikator biologi untuk menetapkan nilai-D. Penggunaan metode berbeda akan memberikan hasil berbeda lebih kepada sebagai alat dari pada variasi kinerja indikator biologi.

”Survival time” dan “Kill time”

    Gunakan dua kelompok, masing-masing terdiri dari 10 indikator biologi yang relevan, dalam wadah asli. Tempatkan spesimen tiap kelompok dalam rak spesimen yang memungkinkan tiap spesimen terpapar kondisi sterilisasi pada lokasi khusus dalam bejana REIB.

    Lakukan pemaparan spesimen untuk “survival time” yang disyaratkan, masukkan ke dalam bejana, dan pisahkan wadah yang berisi 10 spesimen. Ulangi prosedur di atas segera, atau panaskan sebelumnya bila selang waktu yang cukup telah dilampaui, sehingga  wadah yang berisi 10 spesimen kedua diperlakukan sama seperti yang pertama kecuali untuk persyaratan “kill time”.

    “Survival time” dan “kill time” untuk seluruh monografi indikator biologi dijelaskan dalam masing-masing monografi.