<51> Uji Batas Mikroba


A.     UJI ENUMERASI MIKROBA

Pendahuluan

    Bab ini menjelaskan tentang pengujian kuantitatif untuk bakteri mesofil dan kapang yang dapat tumbuh pada kondisi aerob.

    Pengujian ini dirancang untuk menentukan suatu bahan atau sediaan memenuhi spesifikasi mutu secara mikrobiologi yang telah ditetapkan, termasuk jumlah sampel yang akan digunakan dan interpretasi hasil uji.

   Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk produk yang mengandung mikroba viabel sebagai bahan aktif.

   Prosedur mikrobiologi lain termasuk metode otomatisasi dapat digunakan setelah dibuktikan kesetaraannya dengan metode farmakope.

 

Prosedur Umum

    Pengujian dilakukan pada kondisi aseptik sebagai tindakan pencegahan untuk menghindari kontaminasi mikroba dari luar produk, tetapi  tidak mempengaruhi mikroba yang diuji.

    Jika produk mempunyai aktifitas antimikroba sebelum diuji lakukan netralisasi menggunakan inaktivator yang telah dibuktikan tidak toksik terhadap mikroba yang diuji.

    Jika zat aktif permukaan digunakan untuk penyiapan sampel, tidak boleh bersifat toksik terhadap mikroorganisme dan harus kompatibel dengan inaktivator yang digunakan.

 

Metode Penghitungan

    Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin (APM)  yang umum digunakan untuk produk dengan tingkat kontaminasi rendah.

    Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan yang ditentukan dan ukuran sampel yang memadai untuk memperkirakan kesesuaian secara spesifik. Kesesuaian metode yang dipilih harus ditetapkan.

 

UJI FERTILITAS, KESESUAIAN METODE PENGHITUNGAN DAN KONTROL NEGATIF

Ketentuan Umum

    Kemampuan metode untuk mendeteksi mikroba pada produk harus ditetapkan.

    Jika terjadi perubahan kinerja pengujian pada produk yang mempengaruhi hasil uji, maka harus  dilakukan verifikasi terhadap kesesuaian metode.

 

Penyiapan Galur Mikroba Uji

    Gunakan suspensi mikroba uji terstandar yang stabil. Galur mikroba uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih  tidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli. Biakkan tiap galur bakteri dan kapang uji secara terpisah seperti yang tertera pada Tabel 1.

    Untuk membuat suspensi mikroba uji gunakan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0 atau Dapar fosfat pH 7,2; untuk memisahkan spora Aspergillus brasiliensis tambahkan polisorbat 80 P 0,05% pada dapar. Gunakan dapar dalam waktu 2 jam atau dalam 24 jam jika disimpan pada 2º – 8º. Setelah dipilih untuk menyiapkan suspensi segar sel vegetatif A.brasiliensis atau B.subtilis, siapkan suspensi spora yang stabil dan gunakan untuk inokulum dalam pengujian dengan volume yang sesuai. Suspensi spora yang stabil dipelihara pada 2º – 8º untuk jangka waktu yang tervalidasi.

 

Kontrol Negatif

    Untuk membuktikan kesesuaian kondisi pengujian, kontrol negatif dilakukan menggunakan pengencer yang sesuai seperti pada penyiapan larutan uji. Tidak boleh terjadi pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif dilakukan pada saat pengujian seperti yang tertera pada Pengujian Sediaan. Kegagalan kontrol negatif memerlukan investigasi.

    

Fertilitas Media

    Uji setiap bets media jadi dan setiap bets media yang dibuat dari media kering atau dari bahan yang tertera pada formula.

    Inokulasi sejumlah kecil mikroba (tidak lebih dari 100 koloni per plate) ke dalam Soybean-Casein Digest Broth, Soybean-Casein Digest Agar dan Sabouraud Dextrose Agar seperti tertera pada Tabel 1. Inkubasi sesuai dengan kondisi yang tertera pada Tabel 1.

    Untuk media padat, pertumbuhan yang diperoleh tidak boleh berbeda dua kali dari nilai hitung inokulum standar. Pertumbuhan mikroba dan hasil uji fertilitas pada inokulum yang dibuat segar harus sebanding dengan bets sebelumnya. Media cair dapat digunakan jika pertumbuhan mikroba uji terlihat jelas dan sebanding dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.


 

 

Tabel 1.

Penyiapan dan Penggunaan Mikroba Uji

 

Fertilitas

Kesesuaian Metode Penghitungan dalam Sediaan

Mikroba Uji

Penyiapan Galur Uji

Penghitungan Total Mikroba Aerob

Penghitungan Total Kapang dan Khamir

Angka Lempeng Total Mikroba Aerob

Angka Kapang dan Khamir

Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, atau NBRC 13276

Soybean-Casein Digest Agar atau Soybean- Casein Digest Broth,

30-35°,

18-24 jam

Soybean-Casein Digest Agar atau Soybean- Casein Digest Broth

?100 koloni,

30-35°,

? 3 hari

 

Soybean-Casein Digest Agar/APM Soybean-Casein Digest Broth

?100 koloni,

30-35°,

? 3 hari

 

Pseudomonas aeruginosa    ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 atau NBRC 13275

Soybean-Casein Digest Agar atau Soybean- Casein Digest Broth,

30-35°,

18-24 jam

Soybean-Casein Digest Agar atau Soybean- Casein Digest Broth,

?100 koloni

30-35°,

? 3 hari

 

Soybean-Casein Digest Agar/APM Soybean-Casein Digest Broth,

?100 koloni,

30-35°,

? 3 hari

 
Bacillus subtilis ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62 atau NBRC 3134

Soybean-Casein Digest Agar atau Soybean- Casein Digest Broth ,

30-35°,

18-24 jam

Soybean-Casein Digest Agar atau Soybean- Casein Digest Broth

?100 koloni,

30-35°,

? 3 hari

 

Soybean-Casein Digest Agar/APM Soybean-Casein Digest Broth

?100 koloni,

30-35°,

? 3 hari

 

 
Candida albicans  ATCC 10231, NCPF 3179, IP  48.72 atau NBRC 1594

Sabouraud Dextrose Agar atau Sabouraud Dextrose Broth,

20-25°,

2-3 hari

Soybean-Casein Digest Agar

?100 koloni,

30-35°,

? 5 hari

 

Sabouraud Dextrose Agar

?100 koloni,

20-25°,

? 5 hari

 

Soybean-Casein Digest Agar

?100 koloni,

30-35°,

? 5 hari

APM: tidak ada

Sabouraud Dextrose Agar

?100 koloni,

20-25°,

? 5 hari

 

Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83 atau NBRC 9455

Sabouraud Dextrose Agar atau Potato-Dextrose Agar

20-25°,

5-7 hari, atau hingga diperoleh sporulasi yang baik

Soybean-Casein Digest Agar,

?100 koloni,

30-35°C

? 5 hari

 

Sabouraud Dextrose Agar,

?100 koloni,

20-25°,

? 5 hari

 

Soybean-Casein Digest Agar,

?100 koloni,

30-35°C,

? 5 hari

APM: tidak ada

Sabouraud Dextrose Agar,

?100 koloni,

20-25°,

? 5 hari


 

Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba

 dalam Sediaan

PENYIAPAN SAMPEL

    Metode penyiapan sampel disesuaikan dengan sifat fisik sediaan yang diuji. Jika dengan prosedur yang diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan maka harus dikembangkan prosedur lain yang sesuai.

    Sediaan Larut Air Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth bila perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan dengan pelarut yang sama.

    Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam Air Suspensikan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth. Dapat ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1 g per L untuk membantu mensuspensikan bahan yang sulit dibasahi, jika perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan dengan pelarut yang sama.

    Sediaan Berlemak Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji dalam isopropil miristat steril yang disterilkan dengan cara penyaringan atau campurkan sediaan yang akan diuji dengan sesedikit mungkin surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan non-inhibitor lain steril, jika perlu hangatkan dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 40º atau pada kasus tertentu tidak lebih dari 45º. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air. Tambahkan secukupnya pengencer yang telah dihangatkan hingga diperoleh pengenceran 1 dalam 10. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dengan waktu sesingkat mungkin untuk pembentukan emulsi. Lakukan pengenceran bertingkat dengan pengencer yang sesuai mengandung surfaktan Polisorbat 80 P dengan kadar sesuai atau surfaktan non-inhibitor lain steril.

    Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptik dalam penyaring membran atau wadah steril yang sesuai untuk pengambilan sampel. Gunakan seluruh isi atau sejumlah tertentu sediaan dari tiap wadah yang diuji.

    “Transdermal Patches” Lepaskan lapisan, letakkan bagian berperekat menghadap ke atas pada lempeng kaca steril atau baki plastik. Agar tidak saling menempel tutup permukaan berperekat dengan bahan berpori steril yang sesuai (misal kasa steril), kemudian pindahkan lembaran transdermal dalam wadah berisi pengencer yang mengandung polisorbat 80 P atau lesitin dengan volume yang sesuai. Kocok kuat selama tidak kurang dari 30 menit.

 

INOKULASI DAN PENGENCERAN

    Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan suspensi kontrol (pengencer tanpa sampel) seperti yang tertera di atas, untuk mendapatkan inokulum dengan jumlah tidak lebih dari 100 koloni. Volume suspensi inokulum tidak lebih dari 1% dari volume sediaan yang diencerkan.

    Untuk menunjukkan perolehan kembali mikroba uji yang dapat diterima dari sediaan, faktor pengenceran terendah dari sampel yang disiapkan harus digunakan untuk pengujian. Jika hal tersebut tidak memungkinkan karena adanya aktifitas antimikroba atau kelarutan sediaan yang rendah, perlu dikembangkan protokol uji yang sesuai. Jika sifat penghambatan pertumbuhan dari sampel tidak dapat dihindari, maka jumlah total suspensi mikroba uji mungkin harus ditambah setelah proses netralisasi dengan pengenceran atau penyaringan.

 

NETRALISASI/PENGHILANGAN

AKTIFITAS ANTIMIKROBA

    Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel yang disuspensikan seperti tertera pada Inokulasi dan Pengenceran, diinkubasi mengikuti prosedur yang tertera pada Perolehan kembali mikroba uji dalam sediaan, dibandingkan dengan jumlah mikroba uji yang diperoleh kembali dari suspensi kontrol.

Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor reduksi lebih besar dari 2), maka lakukan perubahan prosedur untuk penghitungan khusus untuk meyakinkan validitas hasil. Beberapa contoh perubahan prosedur yaitu dengan :

(1)    Penambahan jumlah volume pengencer atau media biakan;

(2)    Penambahan larutan penetral khusus atau umum pada pengencer;

(3)    Penyaringan membran; atau

(4)    Kombinasi perubahan di atas.

 

    Zat Penetral Zat penetral digunakan untuk menetralkan aktifitas senyawa antimikroba. (seperti yang tertera pada Tabel 2). Zat tersebut dapat ditambahkan pada pengencer atau media yang sesuai sebelum disterilkan. Jika digunakan metode tersebut, efikasi dan hilangnya toksisitas terhadap mikroba harus dibuktikan dengan melakukan penambahan zat penetral pada blangko tanpa sediaan.

 

Tabel 2

Zat Penetral Umum / Metode untuk

Zat Penghambat

Zat Penghambat

Zat Penetral Potensial/Metode

Glutaraldehid, raksa

Natrium hidrogen sulfit (Natrium bisulfit)

Fenolik, alkohol, aldehid, sorbat

Pengenceran

Senyawa amonium kuartener, parahidroksibenzoat (paraben), bis-biguanida

Lesitin

Senyawa amonium kuartener, iodin, paraben

Polisorbat

Raksa

Tioglikolat

Raksa, halogen, aldehid

Tiosulfat

EDTA(edetat)

Ion Mg atau Ca

 

    Jika tidak dapat ditemukan metode netralisasi yang sesuai, dapat diartikan bahwa kegagalan isolasi mikroba yang diinokulasikan disebabkan oleh aktivitas antimikroba dari sediaan. Hal ini    menunjukkan bahwa sediaan tidak terkontaminasi mikroba uji. Ulangi pengujian dengan pengenceran yang lebih tinggi yang sesuai dengan pertumbuhan mikroba uji dan kriteria keberterimaan khusus. 

 

PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI

DALAM SEDIAAN

    Untuk tiap mikroba yang terdaftar, lakukan uji terpisah. Hanya mikroba yang ditambahkan yang dihitung.

Penyaringan Membran Gunakan penyaring membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 µm. Jenis bahan penyaring dipilih sedemikian rupa sehingga kemampuan menahan bakteri tidak dipengaruhi oleh kandungan sampel uji. Gunakan satu jenis membran penyaring untuk tiap mikroba uji.

Pindahkan sejumlah suspensi sampel yang disiapkan seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktifitas Antimikroba (minimal mengandung 1 g sediaan, atau kurang jika diperkirakan jumlah koloni besar) saring segera dan bilas penyaring membran dengan sejumlah tertentu volume pengencer.

    Untuk menentukan angka lempeng total mikroba aerob (ALT), pindahkan penyaring membran ke permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest Agar (SCDA). Untuk menentukan Angka Kapang Khamir (AKK), pindahkan membran ke permukaan lempeng media Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan seperti yang tertera pada Tabel 1. Lakukan pengamatan dan penghitungan.

    Metode Angka Lempeng Total Metode angka lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap media, dan hasil merupakan rata-rata hitung jumlah koloni.

    Metode Tuang Gunakan cawan Petri berdiameter 9 cm, inokulasikan 1 mL suspensi sampel seperti yang tertera pada Preparasi Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi /Penghilangan Aktifitas Antimikroba ke dalam tiap cawan dan kemudian tambahkan 15 - 20 mL Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu tidak lebih dari 45°. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang tercantum pada Tabel 1.

    Inkubasi cawan seperti yang tertera pada Tabel 1. Hitung jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media dan jumlah koloni inokulum awal.

    Metode Sebar Untuk lempeng media gunakan cawan Petri diameter 9 cm, diisi 15-10 mL Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu lebih kurang 45° pada tiap cawan Petri, dan biarkan memadat. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media. Keringkan permukaan lempeng media dalam lemari laminar-airflow atau dalam inkubator. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang tertera pada Tabel 1. Inokulasikan 0,1 mL suspensi sampel yang disiapkan seperti pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba dengan menyebarkan pada permukaan lempeng media. Inkubasi dan hitung jumlah koloni seperti yang telah dijelaskan pada Metode Tuang.

    Metode Angka Paling Mungkin (APM) Presisi maupun akurasi Metode APM kurang dibandingkan dengan Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng Total. Hasilnya tidak dapat diandalkan terutama untuk penghitungan khamir. Metode APM dapat digunakan untuk menghitung ALT jika tidak ada metode lain yang sesuai dan jika telah ditetapkan sebagai metode pilihan.

    Siapkan minimal tiga seri pengenceran (10-1, 10-2, 10-3) suspensi sediaan dengan cara seperti yang tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba. Dari tiap tingkat pengenceran suspensi sediaan inokulasikan masing-masing 1 mL ke dalam tiga seri tabung berisi 9 – 10 mL  media Soybean-Casein Digest Broth. Jika perlu tambahkan surfaktan seperti polisorbat 80 P atau inaktivator zat antimikroba ke dalam media. Jika dibuat tiga tingkat pengenceran, maka diperoleh 9 tabung terinokulasi. Inkubasi semua tabung yang telah diinokulasi pada suhu 30° - 35° selama tidak lebih dari 3 hari. Jika terdapat kesulitan dalam membaca hasil, atau ketidakyakinan terhadap sifat dari sediaan yang diuji, lakukan sub-kultur pada media yang sama atau Soybean Casein Digestic Agar selama satu sampai 2 hari pada suhu yang sama, gunakan hasil ini. Dengan menggunakan Tabel 3 dapat ditentukan angka paling mungkin (APM) per g atau mL sediaan uji.

 

Tabel 3 Nilai Angka Paling Mungkin Mikroba

Kombinasi Jumlah Tabung Pada Tiap Seri yang Menunjukkan Pertumbuhan

APM

per g atau per mL sediaan

Batas Kepercayaan 95%

Jumlah g atau mL sediaan per tabung

 

 

0,1

0,01

0,001

 

 

0

0

0

<3

0-9,4

0

0

1

3

0,1-9,5

0

1

0

3

0,1-10

0

1

1

6,1

1,2-17

0

2

0

6,2

1,2-17

0

3

0

9,4

3,5-35

1

0

0

3,6

0,2-17

1

0

1

7,2

1,2-17

1

0

2

11

4-35

1

1

0

7,4

1,3-20

1

1

1

11

4-35

1

2

0

11

4-35

1

2

1

15

5-38

1

3

0

16

5-38

2

0

0

9,2

1,5-3,5

2

0

1

14

4-35

2

0

2

20

5-38

2

1

0

15

4-38

2

1

1

20

5-38

2

1

2

27

9-94

2

2

0

21

5-40

2

2

1

28

9-94

2

2

2

35

9-94

2

3

0

29

9-94

2

3

1

36

9-94

3

0

0

23

5-94

3

0

1

38

9-104

3

0

2

64

16-181

3

1

0

43

9-181

3

1

1

75

17-199

3

1

2

120

30-360

3

1

3

160

30-380

3

2

0

93

18-360

3

2

1

150

30-380

3

2

0

93

18-360

3

2

2

210

30-400

3

2

3

290

90-990

3

3

0

240

40-990

3

3

1

460

90-1980

3

3

2

1100

200-4000

3

3

3

>1100

 

 

HASIL DAN INTERPRETASI

    Jika ada kesesuaian antara Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng, hitung jumlah rata-rata mikroba uji dengan nilai keberterimaan tidak lebih dari faktor 2 suspensi kontrol tanpa sediaan seperti yang tertera pada Inokulasi dan Pengenceran.

    Jika ada kesesuaian dengan Metode APM nilai inokulum yang dihitung harus dalam batas kepercayaan 95% dari nilai suspensi kontrol.

    Jika kriteria tersebut di atas tidak dapat dipenuhi untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan metode tersebut di atas, maka metode dan kondisi uji harus mendekati kriteria yang digunakan untuk menguji sediaan.

 

PENGUJIAN SEDIAAN

Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian

    Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g atau 10 mL sediaan uji yang diambil dengan cara seperti di atas. Untuk sediaan cairan atau padatan dalam aerosol gunakan 10 wadah sampel, demikian juga untuk sampel “transdermal patches”.

    Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan dengan bahan aktif yang dibuat dalam tiap unit dosis (contoh tablet, kapsul, injeksi) kurang dari atau sama dengan 1 mg, atau jumlah per g atau mL (untuk penyiapan sampel tidak dalam unit dosis) kurang dari 1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang diuji tidak kurang dari 10 unit dosis atau 10 g atau 10 mL sediaan.

 Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari 1000 mL atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus 1% dari bets kecuali jumlah yang lebih kecil  ditentukan atau dinyatakan dan disetujui.

Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang dari 200 unit (misal sampel untuk uji klinis), ukuran sampel dapat dikurangi menjadi dua unit atau satu unit jika kurang dari 100 unit.

    Ambil sampel secara acak dari ruahan sediaan atau dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan sejumlah isi wadah hingga mencapai jumlah sampel yang cukup.

 

Pemeriksaan Sediaan

PENYARINGAN MEMBRAN

    Gunakan alat penyaring yang dirancang sedemikian rupa sehingga memungkinkan pemindahan membran penyaring ke media. Siapkan sampel menggunakan metode yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan, pindahkan sejumlah yang sesuai pada dua penyaring membran, saring segera. Bilas tiap penyaringan sesuai dengan prosedur.

    Untuk menentukan ALT, pindahkan satu penyaring membran ke permukaan Soybean-Casein Digestic Agar. Untuk menentukan AKK, pindahkan satu penyaring membran yang lain ke permukaan Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama 5-7 hari. Hitung jumlah koloni per g atau per mL sediaan.

    Untuk pengujian sampel “transdermal patches”, secara terpisah saring 10% dari volume larutan seperti yang tertera pada Penyiapan Sampel, gunakan dua penyaring membran steril. Pindahkan satu membran pada Soybean-Casein Digest Agar untuk ALT dan membran lainnya pada Sabouraud Dextrose Agar untuk AKK.

 

METODE ANGKA LEMPENG TOTAL

    Metode Tuang Siapkan sampel menggunakan metode yang sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan untuk masing-masing media sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap tingkat pengenceran. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari dan cawan  Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama 5-7 hari. Pilih cawan dari satu tingkat pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi yang kurang dari 250 untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK. Hitung jumlah rata-rata koloni dalam media biakan dan jumlah koloni per g atau per mL sediaan.

    Metode Sebar Siapkan sampel dengan metode yang sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap media dan tiap tingkat pengenceran. Untuk inkubasi dan penghitungan jumlah koloni, lakukan seperti yang tertera pada Metode Tuang.

 

 

 

METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM)

    Siapkan dan encerkan sampel dengan metode sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Inkubasi semua tabung selama 3-5 hari pada suhu 30°-35°. Jika perlu lakukan subkultur, gunakan metode yang sesuai. Catat jumlah tabung yang menunjukkan pertumbuhan mikroba pada tiap tingkat pengenceran. Tentukan APM mikroba per g atau mL sediaan berdasarkan Tabel 3.

 

Interpretasi Hasil

Angka Lempeng Total (ALT) dianggap sama dengan angka koloni yang ditemukan pada Soybean-Casein Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan pada media ini, dihitung sebagai bagian dari jumlah ALT. Angka Kapang dan Khamir (AKK) dianggap sama dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Sabouraud Dextrose Agar; jika koloni bakteri ditemukan pada media ini, maka dihitung sebagai bagian dari AKK. Jika AKK diperkirakan melebihi kriteria keberterimaan berdasarkan pertumbuhan bakteri, dapat digunakan Sabouraud Dextrose Agar yang mengandung antibiotik. Jika penghitungan dilakukan menggunakan metode APM, maka nilai penghitungan yang diperoleh merupakan angka total mikroba aerobik (ALT).

    Jika telah ditetapkan kriteria keberterimaan untuk mutu mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai berikut:

-   101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 20;

-   102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 200;

-   103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 2000; dan seterusnya.

Larutan dan media yang disarankan tertera pada Pengujian Mikroba Spesifik.

 

B.      PENGUJIAN MIKROBA SPESIFIK

 

PENDAHULUAN

    Pada Bab ini akan dijelaskan tentang Uji Batas Mikroba Spesifik yang mungkin terdeteksi dengan kondisi dan metode yang sesuai.

    Metode uji dirancang untuk menetapkan suatu produk memenuhi kriteria mutu secara mikrobiologi. Untuk pelaksanaan pengujian ikuti petunjuk di bawah ini, termasuk jumlah sampel dan interpretasi hasil uji.

    Metode pilihan termasuk metode otomatis dimungkinkan untuk digunakan setelah dibuktikan kesetaraannya dengan metode farmakope.

 

PROSEDUR UMUM

    Penyiapan sampel dilakukan seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba.

    Jika produk yang akan diuji memiliki aktifitas antimikroba, sebaiknya sifat antimikroba dihilangkan atau dinetralkan seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba.

    Jika digunakan bahan aktif permukaan (surfaktan) untuk penyiapan sampel, harus dapat dibuktikan sesuai dan tidak toksik bagi mikroba dan sesuai dengan inaktivator yang digunakan dalam produk yang diuji seperti yang tertera pada Uji enumerasi mikroba.

 

FERTILITAS DAN DAYA HAMBAT MEDIA, KESESUAIAN UJI DAN KONTROL NEGATIF

    Kemampuan metode deteksi mikroba yang terdapat dalam produk yang diuji harus ditetapkan. Jika ada perubahan kemampuan dalam pengujian atau ada perubahan dalam produk yang dapat mempengaruhi hasil uji, harus dilakukan konfirmasi metode.

 

Penyiapan Galur Uji

   Gunakan suspensi galur uji baku yang stabil. Galur uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih  tidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli.

 

MIKROBA AEROB

   Biakkan masing-masing galur bakteri di bawah ini, pisahkan masing-masing dalam wadah berisi media Soybean-Casein Digest Broth atau Soybean-Casein Digest Agar, pada suhu 30? - 35? selama 18 - 24 jam. Biakkan galur uji Candida albicans dalam Sabouraud Dextrose Agar atau Sabouraud Dextrose Broth, pada suhu 20? - 25? selama 2 - 3 hari.

 

Staphylococcus aureus

ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 atau NBRC13276

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 atau NBRC 13275

Escherichia coli

ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 atau NBRC 3972

Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium atau sebagai pilihan lain

ATCC 14028

Salmonella enterica subsp enterica serovar Abony

NBRC 100797, NCTC 6017 atau CIP 80.39

Candida albicans

ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 atau NBRC 1594

 

Gunakan Dapar Natrium Klorida–Pepton pH 7 atau Dapar Fosfat pH 7,2 untuk membuat suspensi uji. Gunakan suspensi tersebut dalam waktu 2 jam atau jika digunakan sampai 24 jam harus disimpan pada suhu 2° - 8°.

 

CLOSTRIDIA

    Gunakan Clostridium sporogenes seperti ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) atau ATCC 19404 (NCTC 532 atau CIP 79.3). Biakkan galur uji Clostridia dalam keadaan anaerob pada Reinforce Medium for Clostridia pada suhu     30° - 35° selama 24 - 48 jam. Sebagai pilihan lain, siapkan dan encerkan sel vegetatif dalam bentuk suspensi segar. Suspensi spora stabil pada suhu 2° - 8° selama periode yang tervalidasi.

 

Kontrol Negatif

    Untuk verifikasi kesesuaian kondisi pengujian, kontrol negatif dilakukan menggunakan pelarut yang sesuai menggantikan sediaan uji. Tidak boleh terjadi pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan pada saat dilakukan uji terhadap sediaan seperti yang tertera pada Pengujian Sediaan. Apabila terjadi kegagalan pada kontrol negatif diperlukan investigasi.

 

Fertilitas dan Daya hambat Media

    Uji setiap bets media siap-pakai, media yang disiapkan dari media kering atau dari komponen media. Verifikasi sifat seperti yang tertera pada Tabel 1

    Uji Fertilitas Media Cair Inokulasikan ke dalam media yang sesuai, mikroba uji dalam jumlah sedikit (tidak lebih dari 100 koloni), inkubasi pada suhu tertentu, tidak lebih dari periode terpendek yang  tertera pada prosedur uji. Untuk media cair, pertumbuhan mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

    Uji Fertilitas Media Padat Gunakan Metode Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan dengan sejumlah mikroba uji yang sesuai (tidak lebih dari 100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu tidak lebih dari periode terpendek seperti tertera dalam prosedur uji. Pertumbuhan mikroba sama dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Uji Daya Hambat Media Cair atau Padat   Inokulasikan sejumlah mikroba uji paling sedikit 100 koloni pada sejumlah media yang diinkubasi pada suhu tertentu tidak kurang dari periode terpanjang seperti tertera pada Prosedur uji. Tidak boleh ada pertumbuhan mikroba uji.

“Test for Indicative Properties” Gunakan Metode Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan dengan mikroba sesuai (tidak boleh lebih dari 100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu dalam batas uji. Ciri koloni mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan inokulum yang sebelumnya.

 

Kesesuaian Metode Uji

    Untuk masing-masing sediaan baru yang diuji lakukan penyiapan sampel, seperti tertera pada Pengujian Sediaan. Pada saat inokulasi suspensi sampel, tambahkan masing-masing galur mikroba uji  tidak lebih dari 100 koloni dalam media pertumbuhan yang telah ditentukan.

    Lakukan uji seperti tertera pada Pengujian Sediaan dengan masa inkubasi terpendek.Mikroba uji spesifik harus dapat dideteksi dengan reaksi dan sifat-sifat seperti dijelaskan dalam Pengujian Sediaan.

Modifikasi prosedur uji untuk menetralkan aktifitas antimikroba harus dilakukan (tertera pada Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba

dalam Uji Enumerasi Mikroba).

    Untuk sediaan yang telah diberi penetral aktivitas antimikroba dengan mengacu pada prosedur yang sesuai, dan ternyata aktivitas antimikroba tidak dapat dinetralkan, maka diasumsikan bahwa tidak ada mikroba yang terhambat dalam sediaan.

 

Tabel 1 Uji Fertilitas, Penghambatan dan “Test for Indicative Properties”

Uji/Media

Sifat

Mikroba Uji

Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif

 

 

Media Cair Pengkaya Enterobacteriaceae Mossel

Fertilitas

E. coli

P.aeruginosa

Daya hambat

S. aureus

Violet Red Bile Glucose Agar

Fertilitas + indikatif

E.coli

P.aeruginosa

Uji Escherichia coli

 

 

MacConkey Broth

Fertilitas

E.coli

Daya hambat

S. aureus

MacConkey Agar

Fertilitas + indikatif

E.coli

Uji Salmonella

 

 

Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth

Fertilitas

Salmonella enterica subsp. entericaserovar Typhimurium atau

 

Salmonella enterica subsp. entericaserovar Abony

Daya hambat

S.aureus

Xylose Lysine Deoxycholate Agar

Fertilitas + indikatif

Salmonella enterica subsp.entericaserovar Typhimurium atau Salmonella enterica subsp. entericaserovar Abony

 

Uji Pseudomonas aeruginosa

 

 

Cetrimide Agar

Fertilitas

P.aeruginosa

 

Daya hambat

E.coli

Uji Staphylococcus aureus

 

 

Mannitol Salt Agar

Fertilitas + indikatif

S.aureus

 

Daya hambat

E.coli

Uji Clostridia

 

 

Reinforced Medium for Clostridia

Fertilitas

Cl.sporogenes

Columbia Agar

Fertilitas

Cl.sporogenes

Uji Candida albicans

 

 

Sabouraud Dextrose Broth

Fertilitas

C.albicans

Sabouraud Dextrose Agar

Fertilitas + indikatif

C.albicans


 

PENGUJIAN SEDIAAN

Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif

    Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi

Siapkan sampel 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak lebih dari 1 g sampel diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba, gunakan Soybean-Casein Digest Broth sebagai pengencer, campur, dan inkubasi pada suhu 20° - 25° selama waktu yang cukup untuk menumbuhkan bakteri tetapi tidak cukup untuk memicu multiplikasi mikroba (biasanya 2 jam tapi tidak boleh lebih dari 5 jam).

 

Uji negatif

Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, gunakan 1 g sediaan seperti yang tertera pada Penyiapan Sampel dan Pra-inkubasi, dalam media cair pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 4 - 48 jam. Lakukan subkultur pada cawan Violet Red Bile Glucose Agar. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. Sampel memenuhi syarat bila tidak ada pertumbuhan koloni.

 

    Uji Kuantitatif

    Seleksi dan subkultur Inokulasi sejumlah suspensi dengan penyiapan sampel langsung ke dalam media Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Encerkan suspensi sampel hingga mengandung 0,1 g, 0,01 g dan 0,001 g (atau 0,1 mL, 0,01 mL dan 0,001 mL), dan inkubasi pada suhu    30° - 35° selama 24-48 jam. Lakukan sub-kultur dengan menginokulasi masing-masing biakan pada cawan media Violet Red Bile Glucose Agar, inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 – 24 jam.

Interpretasi Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan koloni.

Catat hasil positif pada jumlah terkecil sediaan dan hasil negatif pada jumlah terbesar sediaan. Tentukan Angka Paling Mungkin (APM) dari bakteri menggunakan Tabel 2.

 

Tabel 2 Interpretasi Hasil

Hasil dari masing-masing jumlah sediaan

APM / g atau /mL sediaan

0,1 g atau 0,1 mL

0,01 g atau 0,01 mL

0,001 g atau    0,001 mL

+

+

+

Lebih dari 103

+

+

-

Kurang dari 103 dan lebih dari 102

+

-

-

Kurang dari 102 dan lebih dari 10

-

-

-

Kurang dari 10

 

 

Escherichia coli

Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL atau sejumlah sesuai sampai 1 g atau 1 mL, inokulasi ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah seperti tertera dalam Kesesuaian Metode Uji, campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. 

Seleksi dan Subkultur Kocok wadah, pindahkan 1 mL biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 100 mL MacConkey Broth, inkubasi pada suhu 42° - 44° selama 24 - 48 jam. Inokulasi biakan MacConkey Broth pada cawan media Mac Conkey Agar, suhu 30° - 35° selama 18 - 72 jam.

Interpretasi Pertumbuhan koloni menunjukkan adanya E.Coli yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.

Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

 

Salmonella

Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Siapkan sediaan uji seperti yang tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan jumlah yang sesuai, tidak kurang dari 10 g atau 10 mL, inokulasi ke dalam sejumlah volume Soybean-Casein Digest Broth yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18-24 jam.

    Seleksi dan Subkultur Pindahkan 0,1 mL biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 10 mL media Rappaport Vasiliadis Salmonella Enrichment Broth, inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. Subkultur pada cawan Xylose Lysine Deoxycholate Agar, inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 48 jam.

    Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna merah, dengan atau tanpa titik hitam di bagian tengah menunjukkan karakteristik Salmonella yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.

    Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh tidak seperti yang diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

 

Pseudomonas aeruginosa

Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak lebih dari 1 g sediaan diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 mL, inokulasi ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. 

Untuk menguji “transdermal patches”, gunakan membran penyaring steril, saring sejumlah volume sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat “Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel dalam Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring membran ke dalam 100 mL media Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18-24 jam.

Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan media Cetrimide Agar dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 72 jam.

Interpretasi Pertumbuhan koloni menunjukkan adanya P.aeruginosa yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.

    Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh tidak seperti yang diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

 

Staphylococcus aureus

Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti yang tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 mL, inokulasi ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah yang sesuai (seperti yang tertera pada Kesesuaian Metode Uji) campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam.

Untuk menguji “transdermal patches”, gunakan membran penyaring steril, saring sejumlah volume sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat “Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel dalam Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring membran ke dalam 100 mL media Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam.

Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan media Mannitol Salt Agar dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 72 jam.

Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna kuning atau putih dikelilingi zona kuning menunjukkan adanya S.aureus yang di konfirmasi dengan uji identifikasi.

    Sediaan memenuhi syarat uji jika pertumbuhan koloni tidak seperti diuraikan atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

 

Clostridia

Penyiapan Sampel dan Perlakuan Panas Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer (dengan total volume minimum 20 mL) tidak kurang dari 2 g atau 2 mL sediaan untuk diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Pisahkan sampel menjadi dua bagian, sekurang-kurangnya 10 mL. Panaskan satu bagian pada 80° selama 10 menit, dinginkan dengan cepat. Satu bagian lainnya tidak dipanaskan.

Seleksi dan Subkultur Gunakan 10 mL atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 mL kemudian keduanya diinokulasi ke dalam sejumlah Reinforced Medium for Clostridia yang sesuai, (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji). Inkubasi pada kondisi anaerob pada suhu 30° - 35° selama 48. Sesudah inkubasi buat subkultur dari tiap wadah pada Columbia Agar dan inkubasi pada kondisi anaerob pada suhu 30° - 35° selama 48 - 72 jam.

Interpretasi Pertumbuhan koloni anaerob bentuk batang (dengan atau tanpa endospora) memberikan reaksi katalase negatif, menunjukkan adanya Clostridia yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.

Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

 

Candida albicans

Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan sediaan yang akan diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL atau jumlah yang sesuai tidak kurang dari 1 g atau 1 mL, inokulasi ke dalam 100 mL media Sabouraud Dextrose Broth, campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari. 

    Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 24 - 48 jam.

Interpretasi Adanya pertumbuhan koloni berwarna putih menunjukkan adanya C.albicans. yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.

    Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada pertumbuhan koloni seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

 

LARUTAN DAN MEDIA KULTUR

YANG DISARANKAN

 

[Catatan Bagian ini sebagai informasi.]

Larutan dan media kultur berikut memenuhi tujuan seperti tertera pada uji kontaminasi mikroba dalam Farmakope. Media lain mungkin dapat digunakan setelah kesesuaiannya dibuktikan.

Larutan Dapar Persediaan Timbang 34 g Kalium Dihidrogen Fosfat P, masukkan ke dalam labu tentukur 1000 mL, larutkan dalam 500 mL air, atur pH menjadi 7,2 ± 0,2, tambahkan air sampai tanda, dan campur homogen.

Masukkan ke dalam wadah, dan sterilisasi. Simpan pada suhu 2° - 8°.

Larutan Dapar Fosfat pH 7,2 Siapkan campuran air dan Larutan Dapar persediaan (800:1 v/v), kemudian sterilisasi.

 

Larutan Dapar Natrium Klorida – Pepton pH 7,0

Kalium dihidrogen fosfat

3,6 g

Dinatrium hidrogen fosfat dihidrat

7,2 g (setara

0,067 M fosfat)

Natrium klorida

4,3 g

Pepton  (daging atau kasein)

1,0 g

Air

1000 mL

Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Soybean-Casein Digest Broth

Pancreatic digest of casein

17,0 g

Papaic digest of soybean

3,0 g

Natrium klorida

5,0 g

Dibasa hidrogen fosfat

2,5 g

Glukosa monohidrat

2,5 g

Air

1000 mL

 Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Soybean-Casein Digest Agar

Pancreatic digest of casein

15,0 g

Papaic digest of soybean

 5,0  g

Natrium klorida

 5,0  g

Agar

15,0 g

Air

1000  mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Sabouraud Dextrose Agar

Dekstrosa

40,0 g

Mixture peptic digest of animal tissue and pancreatic digest of casein (1:1)

10,0 g

Agar

15,0 g

Air

1000  mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Potato Dextrose Agar

Infusion from potatoes

        200    g

Dekstrosa

20,0 g

Agar

15,0 g

Air

1000  mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

 

 

 

Sabouraud Dextrose Broth

Dekstrosa

20,0 g

Mixture Peptic Digest of Animal Tissue and Pancreatic Digest of Casein (1:1)

10,0 g

Air

1000 mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Enterobacteria Enrichment Broth Mossel

Pancreatic digest of gelatin

10,0 g

Glukosa monohidrat

   5,0 g

Dehydrated ox bile

 20,0 g

Kalium dihidrogen fosfat

  2,0 g

Dinatrium hydrogen fosfat dihidrat

  8,0 g

Brilliant green

      15 mg

Air

   1000 mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,2 ± 0,2 pada 25°. Panaskan hingga 100º selama 30 menit dan dinginkan segera.

 

Violet Red Bile Glucose Agar

Yeast extract

3,0 g

Pancreatic digest of gelatin

7,0 g

Bile salts

1,5 g

Natrium klorida

5,0 g

Glukosa monohidrat

     10,0 g

Agar

     15,0 g

Merah netral

       30 mg

Kristal violet

         2 mg

Air

   1000 mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,4 ± 0,2 pada 25°. Panaskan hingga mendidih, jangan dipanaskan menggunakan otoklaf.

 

MacConkey Broth

Pancreatic digest of gelatin

20,0 g

Laktosa monohidrat

10,0 g

Dehydrated ox bile

  5,0  g

Ungu bromokresol

  10  mg

Air

   1000  mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3 ± 0,2 pada 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

MacConkey Agar

Pancreatic digest of gelatin

17,0 g

Peptones (meat and casein)

  3,0 g

Laktosa monohidrat

10,0 g

Natrium klorida

  5,0 g

Bile salts

  1,5 g

Agar

13,5 g

Merah netral

30,0 mg

Kristal violet

   1   mg

Air

   1000  mL

Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,1 ± 0,2 pada suhu 25º. Didihkan selama 1 menit dengan pengadukan konstan, kemudian sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Rappaport Vassiliadis Salmonela Enrichment Broth

Soya peptone

4,5 g

Magnesium klorida heksahidrat

       29,0 g

Natrium klorida

         8,0 g

Dikalium fosfat

 0,4 g

Kalium dihidrogen fosfat

 0,6 g

Malachite green

0,036 g

Air murni

1000 mL

Larutkan dalam keadaan agak hangat. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi, pada suhu tidak lebih dari 115º. Setelah disterilisasi menggunakan otoklaf pH menjadi 5,2 ± 0,2 pada suhu 25º.

 

Xylose Lysine Deoxycholate Agar

Xylose

3,5 g

L-lysine

5,0 g

Laktosa monohidrat

7,5 g

Sukrosa

7,5 g

Natrium klorida

5,0 g

Yeast extract

3,0 g

Merah fenol

80 mg

Agar

13,5 g

Sodium deoksikolat

2,5 g

Sodium tiosulfat

6,8 g

Besi (III) ammonium sitrat

0,8 g

Air

1000 mL

Atur pH sehingga setelah pemanasan menjadi 7,4± 0,2 pada suhu 25°. Panaskan hingga mendidih, dinginkan hingga 50°, tuang ke dalam cawan Petri. Jangan disterilisasi menggunakan otoklaf.

 

Cetrimide Agar

Pancreatic digest of gelatin

20,0 g

Magnesium klorida

1,4 g

Dikalium sulfat

10,0 g

Setrimid

0,3 g

Agar

13,6 g

Air

1000 mL

Gliserol

10,0 mL

Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,2 ± 0,2 pada 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Mannitol Salt Agar

Pancreatic digest of casein

5,0 g

Peptic digest of animal tissue

5,0 g

Beef extract

1,0 g

D-manitol

10,0 g

Natrium klorida

75,0 g

Agar

15,0 g

Merah fenol

0,025 g

Air

1000 mL

Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,4 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Reinforced Medium for Clostridia

Beef extract

10,0 g

Pepton

10,0 g

Yeast extract

 3,0 g

Soluble starch

 1,0 g

Glukosa monohidrat

 5,0 g

Sistein hidroklorida

 0,5 g

Natrium klorida

 5,0 g

Natrium asetat

 3,0 g

Agar

 0,5 g

Air

1000 mL

Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 6,8 ± 0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.

 

Columbia Agar

Pancreatic digest of casein

10,0 g

Meat peptic digest

5,0 g

Heart pancreatic digest

3,0 g

Yeast extract

5,0 g

Maized starch

1,0 g

Natrium klorida

5,0 g

Agar, tergantung pada daya pembentukan gel

10,0-15,0 g

Air murni

1000 mL

Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3±0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi. Dinginkan hingga mencapai 45-50°, bila perlu tambahkan gentamisin sulfat yang setara dengan 20 mg gentamisin basa, dan tuang ke dalam cawan Petri.