Prosedur pengujian yang digunakan untuk menilai tingkat  mutu bahan dan sediaan farmasi yang terdapat dalam farmakope memerlukan berbagai persyaratan.

Cara Pembuatan Obat yang Baik (CPOB)  terkini mempersyaratkan metode yang digunakan untuk menilai kesesuaian mutu bahan dan sediaan farmasi terhadap spesifikasi yang telah ditetapkan harus telah dibuktikan akurasi dan reliabilitasnya.

Pengguna metode-metode  analitik yang tertera dalam farmakope  tidak dipersyaratkan untuk memvalidasi akurasi dan reliabilitas tetapi cukup memverifikasi  kesesuaiannya  pada kondisi nyata penggunaannya.

Validasi Validasi suatu prosedur analisis adalah proses yang ditetapkan melalui kajian laboratorium bahwa karakteristik kinerja prosedur tersebut telah memenuhi persyaratan sesuai dengan tujuan penggunaannya. Jenis karakteristik kinerja analitik yang diuraikan dalam dokumen ini dapat dilihat dalam Tabel 1. Karena pandangan dan pengertian akan terminologi sering berbeda, maka masing-masing karakteristik kinerja analitik  akan diuraikan dan didefinisikan secara khusus dalam bab berikutnya.

Tabel 1

Karakteristik kinerja analitik yang digunakan

dalam validasi metode

Revalidasi Revalidasi perlu dilakukan dalam kasus berikut: penyerahan prosedur analisis yang direvisi kepada Panitia Farmakope, atau penggunaan suatu prosedur umum yang telah ditetapkan  pada produk baru atau bahan baku baru.

Menurut dokumen International Conference on Harmonization (ICH) revalidasi perlu dilakukan jika terjadi : perubahan dalam sintesis senyawa obat, perubahan dalam komposisi sediaan farmasi, dan perubahan dalam prosedur analisis.

Karakteristik Analitik

AKURASI Akurasi suatu prosedur analisis adalah tingkat kedekatan antara hasil pengujian dengan prosedur yang sedang divalidasi terhadap nilai yang benar. Akurasi prosedur analisis harus ditetapkan meliputi rentang nilai benar tersebut.

    Penetapan Dalam kasus pengujian senyawa obat, akurasi ditetapkan dengan penerapan prosedur analisis tersebut pada analit yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan pembanding) atau dengan pembandingan hasil analisis dengan prosedur lain yang telah ditetapkan akurasinya.

    Dalam kasus pengujian senyawa obat dalam produk formulasi, akurasi dapat ditetapkan dengan penerapan prosedur tersebut pada campuran sintetik komponen  sediaan farmasi yang ke dalamnya telah ditambahkan sejumlah analit  dalam  suatu rentang kadar tertentu. Jika hal tersebut tidak dimungkinkan untuk memperoleh semua komponen sediaan farmasi tersebut, maka akurasi ditetapkan dengan menetapkan kadar analit yang ditambahkan dan diketahui jumlahnya ke dalam sediaan farmasi  atau membandingkan hasil penetapan dengan suatu prosedur yang telah diketahui akurasinya.

    Dalam hal analisis kuantitatif cemaran, akurasi ditetapkan terhadap sampel (senyawa obat atau sediaan farmasi) yang telah ditambahkan sejumlah tertentu cemaran. Jika cemaran atau produk degradasi tidak mungkin diperoleh, maka akurasi ditetapkan dengan membandingkan hasil analisis terhadap hasil pengujian prosedur lain yang telah diakui. Jika tidak ada informasi lain, dimungkinkan untuk menghitung jumlah cemaran berdasarkan perbandingan respons dengan respons senyawa obat. Rasio antara respons sejumlah sama cemaran dengan senyawa obat (faktor respons relatif) dapat digunakan jika telah diketahui.

    Akurasi dihitung sebagai persentase perolehan kembali dari penetapan sejumlah analit yang ditambahkan dan diketahui jumlahnya kedalam sampel, atau sebagai selisih antara hasil rata-rata dengan hasil benar yang diterima bersama dengan batas kepercayaannya.

    Dokumen ICH merekomendasikan bahwa akurasi ditetapkan  dengan menggunakan minimal 9 penetapan meliputi 3 tingkat konsentrasi berbeda yang telah ditetapkan (misalnya 3 konsentrasi dan 3 replikasi untuk masing-masing konsentrasi).

    Penilaian akurasi dapat dilakukan dengan berbagai cara, termasuk menilai persen perolehan kembali dari berbagai rentang  pengujian, atau menilai linearitas hubungan antara konsentrasi yang dihitung terhadap konsentrasi sebenarnya. Arah garis lurus hubungan tersebut harus sekitar 1,0 atau mendekati 1,0. Dalam kasus  lain, interval kedekatan harus ditetapkan terlebih dahulu dalam protokol validasi. Kriteria keberterimaan akurasi sangat tergantung kepada jenis pengujian dan keragaman serta sediaan yang diuji.

PRESISI Presisi prosedur analisis adalah tingkat kedekatan diantara hasil uji individu bila prosedur diterapkan berulangkali terhadap sampling ganda atau sampel yang homogen. Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) dari satu seri pengukuran. Presisi merupakan ukuran tingkat reprodusibilitas atau repitibilitas prosedur analisis dalam kondisi kerja normal. Dalam kaitan ini  reprodusibilitas mengacu pada penggunaan prosedur analisis di beberapa laboratorium yang berbeda. Presisi antara  (dikenal juga sebagai ruggedness) menyatakan keragaman dalam laboratorium yang dilakukan  pada hari yang berbeda atau  oleh analis yang berbeda atau peralatan yang berbeda di laboratorium yang sama. Repitibilitas mengacu pada penggunaan prosedur analisis dalam laboratorium yang sama  dalam periode waktu yang singkat oleh analis yang sama dengan peralatan yang sama.

    Penetapan Presisi prosedur analisis ditetapkan dengan menentukan kadar sejumlah memadai dari larutan sampel homogen beberapa kali, sehingga hasil pengujian dapat dihitung secara statistik perkiraan yang sah dari simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Penetapan kadar dalam kaitan ini adalah analisis bebas terhadap sampel yang dilakukan secara lengkap mulai dari penyiapan sampel hingga  diperoleh hasil akhir pengujian.

    Dokumen ICH merekomendasikan bahwa repitibilitas ditentukan dengan menggunakan minimal 9 penetapan meliputi suatu rentang konsentrasi khusus untuk prosedur (misalnya 3 konsentrasi dan 3 replikasi untuk masing-masing konsentrasi, atau minimal 6 penetapan pada konsentrasi uji 100%)

SPESIFISITAS Dokumen ICH mendefinisikan spesifisitas sebagai kemampuan menguji secara tepat suatu analit dengan adanya komponen lain dan diperkirakan ada sebagai cemaran, hasil degradasi, dan matriks sampel. Ketiadaan spesifisitas dari prosedur analisis dapat diatasi dengan penggunaan prosedur analitik pendukung. [Catatan   Beberapa organisasi internasional menggunakan istilah selektivitas untuk menggantikan spesifisitas]. Untuk menjelaskan definisi di atas dapat digunakan implikasi berikut:

Uji identifikasi Prosedur harus menjamin identitas analit.

Uji kemurnian Prosedur harus menjamin dalam penetapan  akurat kandungan cemaran dalam analit (seperti senyawa sejenis, batas logam berat, cemaran organik mudah menguap).

Penetapan kadar Prosedur harus menjamin dan memberikan pernyataan  akurat pada kadar atau potensi analit dalam sampel.

    Penetapan Dalam kasus analisis kualitatif (uji identifikasi) maka prosedur harus menunjukkan kemampuan  untuk memilih antara senyawa-senyawa yang berkaitan erat dengan strukturnya. Ini dapat dikonfirmasi dengan memperoleh hasil positif dari sampel yang mengandung analit dibandingkan dengan hasil negatif dari sampel yang tidak mengandung analit, dan dikonfirmasi bahwa hasil positif tersebut tidak diperoleh dari bahan-bahan yang berstruktur sama atau berdekatan dengan analit.

    Dalam kasus prosedur untuk cemaran, spesifisitas dilakukan dengan menetapkan sejumlah tertentu cemaran yang ditambahkan pada senyawa obat atau sediaan farmasi, dan hasilnya menunjukkan cemaran tersebut ditetapkan dengan akurasi dan presisi yang memadai.

    Dalam kasus penetapan kadar, spesifisitas dapat ditunjukkan dengan tidak adanya pengaruh cemaran atau eksipien pada prosedur. Pada prakteknya, hal ini dapat dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah cemaran atau eksipien pada senyawa obat atau sediaan dan hasil penetapan kadar tidak dipengaruhi oleh adanya bahan-bahan dari luar tersebut.

    Jika baku cemaran atau hasil urai tidak tersedia, maka spesifisitas ditunjukkan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil urai terhadap hasil prosedur lain yang sudah divalidasi. Pembandingan hasil analisis meliputi juga sampel yang disimpan pada kondisi perlakuan yang relevan (misalnya pengaruh cahaya, panas, lembab, hidrolisis asam/basa, dan oksidasi). Dalam kasus uji kemurnian kromatografi, maka profil cemaran harus dibandingkan.

    Dokumen ICH menyatakan jika digunakan prosedur kromatografi, maka kromatogram harus disertakan untuk menunjukkan derajat selektivitasnya, dan puncak harus diberi tanda. Uji kemurnian puncak (dengan ”Diode Array” atau Spektrometri Massa) dapat digunakan untuk menunjukkan bahwa puncak kromatogram analit tidak mengandung komponen lain.

BATAS DETEKSI adalah karakteristik uji batas. Ini merupakan konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat dideteksi, tetapi tidak perlu kuantitatif dalam kondisi percobaan yang ditentukan. Uji batas semata-mata menunjang bahwa konsentrasi analit di bawah atau di atas aras  tertentu. Batas deteksi umumnya dinyatakan sebagai konsentrasi analit (misalnya persen, bpj, bpm) dalam sampel.

    Penetapan Untuk prosedur non-instrumental, batas deteksi umumnya ditetapkan dengan analisis sampel yang mengandung analit dalam kadar yang diketahui dan menentukan kadar analit terendah yang dapat dideteksi dengan baik.

    Untuk prosedur instrumental, pendekatan yang sama dapat digunakan dengan prosedur non-instrumental. Dalam kasus prosedur yang diserahkan untuk dipertimbangkan sebagai prosedur farmakope resmi, semuanya tidak pernah ditentukan batas deteksinya secara tepat. Batas deteksi cukup ditunjukkan rendah dengan analisis sampel yang mengandung kadar analit  di atas atau di bawah batas deteksi yang dipersyaratkan.

    Dalam kasus prosedur analisis instrumental yang menujukkan adanya gangguan latar belakang, dokumen ICH menguraikan pendekatan umum dengan membandingkan hasil pengukuran ”signal” dari sampel dengan konsentrasi analit rendah yang diketahui dengan ”signal” sampel blangko. Konsentrasi minimum analit yang masih dapat dideteksi dapat ditentukan pada perbandingan ”signal-to-noise” 2:1 atau 3:1. Pendekatan lain tergantung pada penetapan arah garis kurva kalibrasi dan standar deviasi respons. Selanjutnya batas deteksi dapat divalidasi dengan menganalisis sejumlah sampel yang diketahui kadarnya mendekati atau dipersiapkan pada batas deteksinya.

BATAS KUANTITASI adalah karakteristik penetapan kuantitatif pada aras rendah dari senyawa dalam matriks sampel, seperti cemaran dalam senyawa obat ruahan dan hasil degradasi dalam sediaan farmasi akhir. Batas kuantitasi  adalah konsentrasi terendah dari analit dalam sampel yang ditetapkan dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima dalam kondisi percobaan yang telah ditetapkan. Batas kuantitasi  dinyatakan sebagai konsentrasi analit (misalnya persen,bpj, bpm) dalam sampel.

    Penetapan Untuk metode non-instrumental, batas kuantitasi umumnya ditetapkan dengan melakukan analisis sampel yang mengandung analit dalam jumlah yang diketahui dan menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.

    Untuk prosedur instrumental, pendekatan yang sama dapat digunakan seperti pada prosedur non-instrumental. Dalam kasus prosedur yang diserahkan untuk dipertimbangkan sebagai prosedur resmi, tidak perlu menentukan batas kuantitasi. Biasanya batas kuantitasi ditetapkan dengan menganalisis sampel dengan konsentrasi analit  di atas atau di bawah aras kuantitasinya.

    Dalam kasus prosedur analisis instrumental yang menunjukkan adanya gangguan latar belakang, dokumen ICH menguraikan pendekatan umum dengan membandingkan hasil pengukuran ”signal” dari sampel yang mengandung analit kadar rendah dengan hasil pengukuran ”signal” sampel blangko. Konsentrasi minimum analit dapat ditentukan pada perbandingan  ”signal-to-noise” 10:1. Pendekatan lain tergantung pada penentuan arah garis kurva kalibrasi dan standar deviasi dari respons. Selanjutnya batas kuantitasi divalidasi dengan analisis terhadap sejumlah sampel yang mengandung analit mendekati atau dipersiapkan mengandung analit pada batas kuantitasinya.

LINEARITAS DAN RENTANG

Linearitas adalah kemampuannya untuk menunjukkan hasil uji yang secara langsung atau dengan melalui transformasi matematik yang tepat proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel dalam rentang yang diberikan. Dalam kaitan ini linearitas mengacu pada  hubungan linear antara konsentrasi dan hasil pengukuran pengujian. Dalam beberapa kasus, untuk mencapai linearitas, konsentrasi atau hasil pengukuran dapat ditransformasi dalam bentuklogaritma, akar kuadrat, resiprokal, atau bentuk transformasi lainnya. Jika linearitas tidak dicapai, maka hubungan non-linear dapat digunakan.

Rentang adalah interval antara batas tertinggi dan batas terendah dari kadar analit yang telah dibuktikan, dapat ditentukan dengan presisi, akurasi dan linearitas yang sesuai menggunakan prosedur analisis yang ditetapkan. Rentang umumnya dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil uji (misalnya persen, bpj, bpm) yang diperoleh dengan prosedur analisis ini.

Penetapan Linearitas dapat ditentukan sepanjang rentang prosedur analisis. Awalnya linearitas digambarkan secara visual antara ”signal” sebagai fungsi dari  konsentrasi analit. Jika terlihat ada hubungan yang linear, hasil uji dapat ditentukan dengan metode statistik yang memadai (misalnya dengan perhitungan garis regresi kuadrat terkecil). Data dari garis regresi dapat membantu untuk menunjukan perkiraan derajat linearitas, seperti koefisien korelasi, perpotongan sumbu y, arah garis regresi dan jumlah kuadrat residu garis regresi yang dapat diterima.

    Rentang prosedur divalidasi dengan membuktikan bahwa prosedur analisis memberikan presisi, akurasi dan linearitas yang dapat diterima ketika diterapkan pada sampel yang mengandung analit pada konsentrasi ekstrim yang berada pada rentang.

    ICH merekomendasikan bahwa linearitas ditetapkan dengan menggunakan minimal 5 konsentrasi yang digunakan secara normal. Dan juga direkomendasikan rentang minimum yang digunakan sebagai berikut:

Penetapan kadar senyawa obat (atau sediaan farmasi  akhir): dari 80% hingga 120% dari konsentrasi uji.

Penetapan cemaran: dari 50% hingga 120% dari kriteria keberterimaan.

Untuk Keseragaman  kandungan: minimal 70% hingga 130% dari konsentrasi uji (sangat tergantung pada sifat alami bentuk sediaan).

Untuk Uji Disolusi: + 20% dari rentang spesifik (misalnya pada sediaan pelepasan terkendali, setelah 1 jam 20%, dan setelah 24 jam lebih dari 90%, maka rentangnya dari  0% hingga 110% dari konsentrasi yang dinyatakan pada etiket).

Ketegaran adalah ukuran kemampuan prosedur untuk tetap bertahan dan tidak terpengaruh oleh keragaman kecil yang disengaja pada parameter prosedur yang terdapat dalam dokumen. Ketegaran dapat ditentukan pada waktu  pengembangan  prosedur analisis.

Kesesuaian Sistem

    Jika pengukuran dapat dipengaruhi oleh keragaman kondisi analisis, maka perlu adanya pengawasan  yang memadai atau pernyataan peringatan yang tertulis dalam prosedur. Salah satu konsekuensi dari pengujian ketegaran adalah parameter kesesuaian sistem yang perlu ditetapkan untuk menjamin validitas prosedur agar tetap bertahan selama digunakan. Keragaman  yang umum adalah stabilitas larutan analisis, perbedaan peralatan, dan perbedaan analis. Dalam hal kromatografi  cair, keragaman yang umum adalah pH fase gerak, komposisi fase gerak, perbedaan lot kolom atau pemasok kolom, suhu dan laju alir fase gerak.  Dalam hal kromatografi gas, variasi yang umum adalah perbedaan lot kolom atau pemasok kolom, suhu dan laju alir fase gerak.    Uji Kesesuaian Sistem berdasarkan pada konsep bahwa peralatan, elektronik, kerja analitik dan sampel merupakan satu sistem yang terpadu yang harus dievaluasi. Parameter kesesuaian sistem yang harus ditetapkan tergantung pada jenis prosedur yang akan dievaluasi. Kesesuaian sistem sangat penting dalam hal prosedur kromatografi. Penyerahan pada Panitia Farmakope hendaknya dilengkapi dengan persyaratan kesesuaian sistem seperti tertera pada Kromatografi <931>.

Unsur Data yang Diperlukan untuk Validasi

Persyaratan pengujian farmakope beragam, mulai dari penetapan analisis tingkat kepastian tinggi sampai evaluasi terhadap karakteristik. Setiap prosedur analisis yang berbeda memerlukan skema validasi yang berbeda. Bagian ini hanya mencakup kategori pengujian secara umum yang memsyaratkan data validasi.  Kategori-kategori tersebut adalah sebagai berikut:

Kategori I Prosedur analisis untuk penetapan  kadar komponen utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif (termasuk pengawet) dalam sediaan obat jadi.

Kategori II Prosedur analisis untuk penetapan  cemaran dalam bahan baku  obat atau senyawa hasil degradasi dalam sediaan obat jadi. Prosedur ini terdiri dari penetapan  kuantitatif dan uji batas.

Kategori III Prosedur analisis untuk penetapan karakteristik kinerja sediaan (misalnya disolusi, pelepasan obat).

Kategori IV Prosedur analisis untuk identifikasi.

Untuk setiap kategori diperlukan informasi analitik yang berbeda. Tabel 2 mencantumkan unsur data yang diperlukan untuk setiap kategori.

Tabel 2 Unsur data yang dibutuhkan untuk validasi prosedur analisis

Catatan :  *   Mungkin dipersyaratkan tergantung pada sifat khusus dari uji

Prosedur umum yang sudah pasti (seperti penetapan kadar air secara titrimetri, penetapan endotoksin bakteri) harus diverifikasi untuk memastikan kesesuaian penggunaan, seperti akurasinya (dan tidak ada pengaruh lain) jika digunakan untuk sediaan atau bahan baku baru.

Validitas suatu prosedur analisis hanya dapat dibuktikan melalui kajian laboratorium. Oleh karena itu kelengkapan dokumentasi dari setiap pengujian merupakan suatu persyaratan dasar dalam menentukan kesesuaian prosedur itu dengan tujuan penggunaannya. Prosedur dalam farmakope harus menunjukkan hasil yang sesuai dalam kondisi nyata, oleh karena itu perlu dilakukan verifikasi.