Conjugated Estrogen
Estrogen Terkonjugasi adalah campuran natrium estron sulfat dan natrium ekuilin sulfat, diperoleh seluruh bagian atau sebagian dari urin ekuin atau dibuat secara sintesa dari estron dan ekuilin. Mengandung zat estrogenik terkonjugasi lain dari tipe yang berasal dari kuda betina hamil, merupakan dispersi zat estrogenik pada serbuk pengencer yang sesuai. Estrogen terkonjugasi mengandung tidak kurang dari 52,5% dan tidak lebih dari 61,5% natrium estron sulfat dan tidak kurang dari 22,5% dan tidak lebih dari 30,5% natrium ekuilin sulfat dan total natrium estron sulfat dan natrium ekuilin sulfat tidak kurang dari 79,5% dan tidak lebih dari 88,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Estrogen Terkonjugasi juga mengandung komponen natrium sulfat terkonjugasi tidak kurang dari 13,5% dan tidak lebih dari 19,5% 17?-dihidroekuilin, tidak kurang dari 2,5% dan tidak lebih dari 9,5% 17?-estradiol dan tidak kurang dari 0,5% dan tidak lebih dari 4,0% 17?-dihidroekuilin dari jumlah yang tertera pada etiket.
Pemerian Estrogen terkonjugasi berasal dari sumber alam, berupa serbuk amorf; kekuningan; tidak berbau atau berbau khas lemah. Bentuk sintetis berupa hablur atau serbuk amorf; putih sampai sedikit kekuningan terang, tidak berbau atau berbau lemah.
Baku pembanding Estron BPFI; tidak boleh dikeringkan. Simpan dalam wadah tertutup rapat dan terlindung cahaya. Ekuilin BPFI; Simpan dalam wadah tertutup rapat, terlindung cahaya dan dalam lemari pendingin. 17?-Dihidroekuilin BPFI; tidak boleh dikeringkan. Simpan dalam wadah tertutup rapat, berisi gas nitrogen, dalam lemari pembeku dan terlindung cahaya. Estradiol BPFI; bentuk hemihidrat tidak boleh dikeringkan, simpan dalam wadah tertutup rapat, terlindung cahaya.
Identifikasi
A. Waktu retensi relatif puncak 17?-dihidroekuilin, estron dan ekuilin dalam Larutan uji sesuai dengan Larutan baku yang diperoleh dari Penetapan kadar.
B. Kromatogram zat dalam Larutan uji pada Penetapan kadar menunjukkan puncak atau berupa bahu tambahan 17?-estradiol dan 17ß-dihidroekuilin dengan waktu retensi relatif terhadap 3-O-metilestron berturut-turut lebih kurang 0,24 dan 0,35.
Komponen lain Kandungan 17?-dihidroekuilin; 17-?-estradiol; 17ß-dihidroekuilin sebagai konjugat natrium sulfat. Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>.
Dapar asetat pH 5,2, Larutan baku internal, Larutan baku persediaan, Larutan baku, Larutan kesesuaian sistem, Larutan uji dan Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada Penetapan kadar.
[Catatan waktu retensi relatif puncak 17?-estradiol, 17?-dihidroekuilin dan 17?-dihidroekuilin, berturut-turut lebih kurang 0,82; 1,00 dan 1,11]. Tetapkan setiap puncak 17?-estradiol, 17?-dihidroekuilin dan 17?-dihidroekuilin dari dari Larutan Uji.
Prosedur Suntikan sejumlah volume sama (lebih kurang 1 µL) Larutan baku dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur respons puncak 17?-estradiol, 17?-dihidroekuilin dan 17?-dihidroekuilin. Hitung persentase 17?-estradiol, 17?-dihidroekuilin dan 17?-dihidroekuilin sebagai garam natrium sulfat dalam zat dengan rumus:
RU dan RS berturut-turut adalah perbandingan respons puncak analit yang sesuai dengan baku internal dalam Larutan uji; dan perbandingan respons puncak 17?-dihidroekuilin dengan baku internal dalam Larutan baku; CS adalah kadar 17?-dihidroekuilin BPFI dalam mg per mL Larutan baku; CU adalah kadar dalam mg per mL Larutan uji; F adalah faktor konversi (perbandingan bobot molekul garam natrium terhadap estrogen bebas), 1,381.
17?-estradiol dan r8,9-dehidroestron Berturut-turut sebagai garam natrium sulfat, tidak lebih dari 2,25% dan 6,25% dari jumlah estrogen terkonjugat yang tertera pada etiket. Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>.
Dapar asetat pH 5,2, Larutan baku internal, Larutan baku persediaan, Larutan baku, Larutan kesesuaian sistem, Larutan uji dan Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada Penetapan kadar.
[Catatan waktu retensi relatif 17ß-estradiol, 3-O-metilestron dan r8,9-dehidroestron berturut-turut lebih kurang 0,29; 1,0 dan 0,9]. Tetapkan setiap puncak 17ß-estradiol, 3-O-metilestron dan r8,9-dehidroestron dari dari Larutan Uji.
Prosedur Suntikan sejumlah volume sama (lebih kurang 1 µL) Larutan baku dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur semua respons puncak. Hitung persentase 17ß-estradiol dan r8,9-dehidroestron sebagai garam natrium sulfat dalam zat dengan rumus :
RU dan RS berturut-turut adalah perbandingan respons puncak analit yang sesuai dengan baku internal dalam Larutan uji dan perbandingan respons puncak estron yang sesuai dengan baku internal dalam Larutan baku; CS dan CU berturut-turut adalah kadar Estron BPFI dalam mg per mL Larutan baku dan kadar dalam mg per mL Larutan uji; F adalah faktor konversi (perbandingan bobot molekul garam natrium terhadap estrogen bebas), 1,381.
Estron, Ekuilin dan 17?-dihidroekuilin (Steroid bebas) Tidak lebih dari 1,3%. Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>.
Dapar asetat pH 5,2, Larutan baku internal, Larutan baku persediaan, Larutan kesesuaian sistem dan Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada Penetapan kadar.
Larutan baku steroid bebas Encerkan sebanyak 10 kali Larutan baku persediaan. Pipet 1,0 mL larutan dan 1,0 mL Larutan baku internal ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir atau bersumbat rapat. Lanjutkan menurut cara yang tertera pada Larutan baku seperti pada Penetapan kadar mulai dengan “Uapkan campuran”.
Larutan uji Lakukan menurut cara yang tertera pada Larutan uji seperti pada Penetapan kadar, tanpa penambahan enzim sulfatase. Masukkan 6,0 mL larutan ke dalam tabung sentrifuga sebagai pengganti 3,0 mL.
Blangko Buat blangko pereaksi dengan cara yang sama seperti pada Larutan uji.
Kesesuaian sistem Lakukan menurut cara yang tertera pada Penetapan kadar, dengan tambahan persyaratan: Pada tidak kurang dari dua kali penyuntikan ulang, simpangan baku relatif untuk perbandingan respons puncak estron dan baku internal dalam Larutan baku steroid bebas tidak lebih dari 5,5%.
Prosedur Suntikan sejumlah volume sama (lebih kurang 1 µL) Larutan baku steroid bebas dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur semua respons puncak. Hitung persentase total estron, ekuilin dan 17?-dihidroekuilin (steroid bebas) dalam zat dengan rumus:
RU dan RS berturut-turut adalah perbandingan jumlah respons puncak estron, ekuilin dan 17?-dihidroekuilin (setiap puncak dikoreksi terhadap Blangko) dengan respons puncak baku internal dalam Larutan uji dan perbandingan respons puncak estron dengan respons puncak baku internal dalam Larutan baku; CS dan CU berturut-turut adalah kadar Estron BPFI dalam mg per mL Larutan baku dan kadar dalam mg per mL Larutan uji.
17?-dihidroekuilenin, 17?- dihidroekuilenin dan Ekuilenin Berturut-turut sebagai garam natrium sulfat, tidak lebih dari 3,25%; 2,75% dan 5,5% dari jumlah zat yang tertera pada etiket.
Dapar asetat pH 5,2, Larutan baku internal, Larutan baku persediaan, Larutan baku, Larutan kesesuaian sistem, Larutan uji dan Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada Penetapan kadar. [Catatan Waktu retensi relatif dihidroekuilenin, 17ß-dihidroekuilenin, 3-O-metilestron dan ekuilenin berturut-turut lebih kurang 0,56; 0,64; 1,0 dan 1,3]. Tetapkan setiap puncak dihidroekuilenin, 17ß-dihidroekuilenin, 3-O-metilestron dan ekuilenin dari dari Larutan Uji.
Prosedur Suntikan sejumlah volume sama (lebih kurang 1 µL) Larutan baku dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur semua respons puncak. Hitung persentase 17?-dihidroekuilenin, 17ß-dihidroekuilenin, dan ekuilenin sebagai garam natrium sulfat dalam zat dengan rumus:
RU dan RS berturut-turut adalah perbandingan respons puncak analit yang sesuai dengan baku internal dalam Larutan uji dan perbandingan respons puncak estron dengan baku internal dalam Larutan baku; CS dan CU berturut-turut adalah kadar Estron BPFI dalam mg per mL Larutan baku dan kadar dalam mg per mL Larutan uji; F adalah faktor konversi (perbandingan bobot molekul garam natrium terhadap estrogen bebas), 1,381.
Penetapan kadar Lakukan penetapan dengan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>.
Dapar asetat pH 5,2 Campur 79 mL natrium asetat LP dan 21 mL asam asetat 1 N, encerkan dengan air hingga 500 mL. Atur pH hingga 5,2±0,1 dengan penambahan asam asetat 1 N atau natrium asetat LP.
Larutan baku internal Timbang saksama sejumlah 3-O-metilestron, larutkan dan encerkan dalam metanol P hingga kadar lebih kurang 150 µg per mL.
Larutan baku persediaan Timbang saksama masing-masing sejumlah Estron BPFI, Ekuilin BPFI dan 17 ?-Dihidroekuilin BPFI, larutkan dan encerkan secara kuantitatif dan bertahap dalam etanol P hingga kadar berturut-turut lebih kurang 160 µg, 70 µg dan 50 µg per mL.
Larutan baku Pipet 1 mL Larutan baku persediaan dan 1 mL Larutan baku internal ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir atau bersumbat rapat. Uapkan campuran tersebut dengan bantuan aliran gas nitrogen P pada suhu di bawah 50º hingga kering. Pada residu kering tambahkan 15 µL piridina P kering dan 65 µL bis(trimetilsilil)trifluoroasetamida P mengandung 1% trimetil klorosilan. Segera tutup rapat tabung sentrifuga, campur dan biarkan selama 15 menit. Tambahkan 0,5 mL toluen P, campur.
Larutan kesesuaian sistem Timbang sejumlah Estradiol BPFI (17?-estradiol), larutkan dalam etanol P hingga kadar lebih kurang 2 µg per mL. Pipet masing-masing 1 mL larutan ini, Larutan baku persediaan dan Larutan baku internal ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir atau bersumbat rapat. Lanjutkan menurut cara yang tertera pada Larutan baku mulai dengan “Uapkan campuran”.
Larutan uji Timbang saksama sejumlah zat, setara dengan 2 mg estrogen terkonjugasi total, masukkan ke dalam tabung sentrifuga 50 mL bertutup ulir berlapis politef berisi 15 mL Dapar asetat pH 5,2 dan 1 g barium klorida P. Tutup rapat tabung sentrifuga, kocok selama 30 menit. Jika perlu atur pH hingga 5,0 ± 0,5 dengan penambahan asam asetat 1 N atau natrium asetat LP. Tempatkan pada tangas sonikator selama 30 detik, kemudian kocok lagi selama 30 menit. Tambahkan enzim sulfatase yang sesuai setara dengan 2500 unit dan kocok selama 20 menit dalam tangas air pada suhu 50°. Tambahkan 15,0 mL dikloroetan P pada campuran hangat, tutup tabung, kocok secara mekanik selama 15 menit. Sentrifus selama 10 menit atau sampai lapisan bawah jernih. Pindahkan sebanyak mungkin lapisan pelarut organik dan saring cepat melalui corong berisi wol kaca kering dan lebih kurang 5 g natrium sulfat anhidrat P. Hindari kehilangan karena penguapan. Pipet 3 mL larutan ini, masukkan ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir atau bersumbat rapat. Tambahkan 1,0 mL Larutan baku internal. Lanjutkan penetapan seperti yang tertera pada Larutan baku, mulai dari “Uapkan campuran”.
Sistem kromatografi Lakukan penetapan menggunakan cara Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala dan kolom kapiler leburan silika 0,25 mm × 15 m dilapisi dengan fase diam G19 setebal 0,25 mm dan suatu sistem injektor split. Pertahankan suhu injektor, detektor dan kolom masing-masing pada 260°, 260° dan 208°. Gunakan hidrogen sebagai gas pembawa dengan laju alir lebih kurang 2 mL per menit dan laju alir pada split adalah 40 - 60 mL per menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan kesesuaian sistem ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur respons puncak: faktor ikutan puncak estron tidak lebih dari 1,3; resolusi, R, antara puncak estron dan ekuilin tidak kurang dari 1,2; simpangan baku relatif perbandingan puncak estron terhadap baku internal pada tidak kurang dari empat kali penyuntikan ulang tidak lebih dari 2,0%.
[Catatan Kondisikan eluasi hingga waktu retensi puncak 3-O-metilestron antara 17 dan 25 menit]
[Catatan Waktu retensi relatif 17b-estradiol, 17a-dihidroekuilin, estron, ekuilin dan 3-O-metilestron berturut-turut lebih kurang 0,29;0,30;0,80;0,87 dan 1,00]
Prosedur Suntikan sejumlah volume sama (lebih kurang 1 µL) Larutan baku dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur respons puncak. Hitung persentase natrium estron sulfat dan natrium ekuilin sulfat dalam zat dengan rumus:
RU dan RS berturut-turut adalah perbandingan respons puncak analit yang sesuai dengan baku internal dalam Larutan uji dan perbandingan respons puncak analit yang sesuai dengan baku internal dalam Larutan baku; CS dan CU berturut-turut adalah kadar Estron BPFI atau Ekuilin BPFI dalam mg per mL Larutan baku dan kadar dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan bobot yang tertera pada etiket; F adalah faktor konversi (perbandingan bobot molekul garam natrium terhadap estrogen bebas), 1,381
Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup baik, simpan dalam suhu ruang terkendali atau dalam lemari pendingin.
Penandaan Pada etiket tertera kandungan estrogen terkonjugasi dinyatakan dalam bobot per bobot.