Potensi fraksi faktor VIII ditetapkan dengan membandingkan jumlah yang diperlukan untuk mengurangi waktu jendal campuran uji yang mengandung semua zat yang berperan dalam penjendalan darah, dengan sejumlah sediaan baku yang diperlukan untuk menimbulkan efek sama dalam kondisi metode penetapan yang sesuai. Metode tahap tunggal dapat digunakan jika memberikan hasil yang tidak berbeda bermakna, menggunakan sediaan baku, dengan memperhatikan ketelitian metode.
Baku pembanding Faktor Koagulasi VIII Darah Manusia BPFI.
Metode Rekonstitusi seluruh isi satu ampul Faktor Koagulasi VIII Darah Manusia BPFI dengan 1 mL air, gunakan segera. Ke dalam Faktor Koagulasi VIII Darah Manusia BPFI yang telah direkonstitusi dan sediaan uji tambahkan Dapar imidazol pH 7,3 secukupnya hingga kadar antara 0,5 dan 2 unit per mL; larutan stabil selama 15 menit pada suhu 20º. Buat 3 pengenceran dengan saksama berturut-turut berkelipatan dua dalam rentang (1 dalam 16) sampai (1 dalam 256) menggunakan campuran 1 bagian volume larutan trinatrium sitrat P 3,8% dan 5 bagian volume larutan natrium klorida P 0,9% hingga waktu jendal antara 17 detik dan 35 detik, gunakan segera. Masukkan ke dalam 6 tabung (75 mm x 10 mm) masing-masing 0,1 mL Larutan faktor jendal V, Pereaksi fosfolipida dan Pereaksi serum normal. Ke dalam tabung pertama, tambahkan 0,1 mL larutan baku pengenceran tertinggi, tempatkan tabung dalam tangas air pada suhu 37º, tambahkan 0,1 mL kalsium klorida 0,05 M dan mulai hitung waktu menggunakan penghitung detik. Menit berikutnya tambahkan 0,1 mL larutan baku pengenceran tertinggi kedua ke dalam tabung kedua, tempatkan tabung ke dalam tangas air dan tambahkan 0,1 mL kalsium klorida 0,05 M pada saat 1 menit menggunakan penghitung detik. Ulangi prosedur untuk larutan baku pengenceran terendah dan larutan uji pengenceran tertinggi sampai terendah hingga kalsium klorida ditambahkan pada saat 2 menit, 3 menit, 4 menit dan 5 menit masing-masing menggunakan penghitung detik.
Siapkan 12 tabung kaca masing-masing mengandung 0,2 mL kalsium klorida 0,025 M dan tabung selanjutnya mengandung 3 mL Plasma substrat. Masukkan dalam tangas air pada suhu 37º. Pada saat 14 menit 40 detik dengan penghitung detik, masukkan 0,1 mL campuran dari tabung inkubasi pertama ke dalam satu tabung yang mengandung 0,2 mL larutan kalsium klorida P dan campur. Pada saat 15 menit, tambahkan 0,2 mL Plasma substrat hangat dan menggunakan penghitung detik kedua, catat sebagai waktu jendal, interval antara penambahan Plasma substrat dan indikasi pertama terbentuknya fibrin yang dapat dilihat secara visual atau dengan alat mekanik. Ulangi prosedur menggunakan tabung inkubasi lain pada interval 1 menit dan lakukan penetapan seri kedua pada saat 21 menit sampai 26 menit. Periode inkubasi diatur hingga waktu jendal dari penetapan yang berkaitan dalam dua seri tidak berbeda lebih dari 5%, dan menunjukkan pembentukan aktivator protrombin plato stabil telah tercapai. Untuk memastikan tidak terdapat cemaran bermakna dari pereaksi dengan faktor jendal VIII, lakukan penetapan blangko dengan cara larutan uji diganti dengan sejumlah setara campuran 1 bagian volume larutan trinatrium sitrat P 3,8% dan 5 bagian volume larutan natrium klorida P 0,9%. Hasil penetapan tidak absah jika waktu jendal yang dicatat dalam penetapan blangko kurang dari 40 detik. Hitung hasil penetapan menggunakan metode statistik baku.
Pereaksi
Larutan faktor jendal V Larutan faktor jendal V dibuat dengan metode di bawah ini atau dengan metode lain dengan meniadakan faktor VIII. Buat dari plasma segar sapi beroksalat dengan fraksinasi pada suhu 4º dengan larutan jenuh amonium sulfat P yang dibuat pada suhu 4º. Gunakan fraksi yang mengendap pada kejenuhan antara 38% dan 50% (mengandung faktor jendal V tidak tercemar dengan faktor jendal VIII secara bermakna), dialisa untuk menghilangkan amonium sulfat dan encerkan dengan larutan natrium klorida P 0,9% hingga diperoleh larutan yang mengandung antara 10 dan 20 % jumlah faktor jendal V yang terdapat dalam plasma segar normal manusia.
Tetapkan kandungan faktor jendal V dalam larutan dengan cara sebagai berikut: Buat dua pengenceran dalam Dapar imidazol pH 7,3 yang mengandung 1 bagian volume larutan uji dalam 10 bagian volume dan 20 bagian volume. Lakukan uji pada tiap pengenceran sebagai berikut: Campur masing-masing 0,1 mL Plasma substrat kekurangan faktor jendal V, enceran larutan uji, ekstrak trombokinase dan kalsium klorida 0,025 M. Catat sebagai waktu jendal, interval antara penambahan larutan kalsium klorida dan indikasi pertama terbentuk fibrin yang dapat dilihat secara visual atau dengan alat mekanik.
Dengan cara yang sama lakukan penetapan waktu jendal rangkap dua, untuk 4 pengenceran dari kumpulan plasma normal manusia dalam Dapar imidazol pH 7,3 yang masing-masing mengandung 1 bagian volume dalam 10 bagian volume (setara dengan 100% faktor jendal V), 50 bagian volume (20%), 100 bagian volume (10%) dan 1000 bagian volume (1%).
Untuk menghitung hasil waktu jendal, buat rata-rata waktu jendal untuk setiap pengenceran plasma manusia pada kertas grafik log putaran ganda terhadap kesetaraan persentase faktor jendal V dan baca persentase faktor jendal V untuk dua pengenceran dari Larutan faktor jendal V dengan cara interpolasi kurva. Rata-rata dari dua hasil yang diperoleh sebagai persentase faktor jendal V dalam larutan.
Pereaksi serum normal Kumpulkan darah normal manusia dalam botol kaca kering steril, inkubasi pada suhu 37º selama 3 jam, biarkan pada suhu 4º selama semalam, pisahkan serum, beku keringkan dan simpan dalam desikator hampa udara di atas fosfor pentoksida P. Larutkan sejumlah serum kering yang dihitung diperoleh dari 1 mL serum dalam Dapar imidazol pH 7,3 secukupnya hingga 10 mL dan biarkan pada suhu 4º selama 24 jam sampai 36 jam.
Otak lembu jantan yang dikeringkan dengan aseton Potong otak segar lembu jantan yang sebelumnya telah dibebaskan dari pembuluh darah dan jaringan ikat menjadi bagian kecil. Masukkan ke dalam aseton P untuk dehidrasi awal. Sempurnakan dehidrasi dengan cara menumbuk sejumlah 30 g bahan di dalam mortir beberapa kali berturut-turut dengan 75 mL aseton P di dalam mortir, beberapa kali berturut-turut sampai diperoleh serbuk kering setelah penyaringan. Kemudian keringkan pada suhu 37º selama 2 jam hingga semua sisa aseton menguap.
Fosfolipida Cuci sejumlah otak manusia normal atau otak sapi dan bebaskan dari selaput otak dan pembuluh darah dan maserasi dalam alat pencampur yang sesuai. Timbang 1000 g sampai 1300 g maserat dan ukur volume (v mL). Ekstraksi tiga kali, tiap kali dengan 4 v mL aseton P, saring dengan diisap dan keringkan endapan pada suhu 37º selama semalam. Ekstraksi endapan kering dua kali, tiap kali dengan 2 v mL campuran 2 bagian volume eter minyak tanah P (jarak didih 30º sampai 40º) dan 3 bagian volume eter minyak tanah P (jarak didih 40º sampai 60º), saring masing-masing ekstrak melalui kertas saring yang sebelumnya telah dicuci dengan campuran eter minyak tanah. Gabungkan ekstrak dan uapkan sampai kering pada suhu 45º pada tekanan tidak lebih dari 5 mmHg. Larutkan sisa dalam 0,2 v mL eter P dan biarkan pada suhu 4º hingga terbentuk endapan. Sentrifus dan uapkan beningan di bawah pengeringan tekanan hingga volume lebih kurang 100 mL per kg dari maserat asal. Biarkan pada suhu 4º hingga terbentuk endapan (12 sampai 24 jam) dan sentrifus. Ke dalam beningan tambahkan 5 bagian volume aseton P, sentrifus, buang beningan, keringkan endapan dan simpan dalam desikator hampa udara terlindung cahaya.
Pereaksi fosfolipida Suspensikan 125 mg fosfolipida dalam 5 mL air, kocok dan aduk hingga diperoleh suspensi yang homogen. Buat pengenceran dengan larutan natrium klorida P 0,9% hingga memberikan perbedaan waktu jendal minimum sesuai dengan perbedaan waktu jendal terbesar antara pengenceran berturut-turut dari sediaan baku dan sediaan uji. Umumnya kadar antara 50 µg dan 250 µg per mL. Suspensi encer dapat disimpan pada suhu -20º selama 6 minggu.
Plasma substrat Pisahkan plasma dari 9 bagian volume darah manusia atau darah sapi yang ditampung dalam 1 bagian volume larutan trinatrium sitrat P 3,8% atau dari 3,5 bagian volume darah manusia atau darah sapi yang ditampung dalam 1 bagian volume larutan yang mengandung dinatrium hidrogen sitrat P 2% dan D-glukosa P 2,5%. Pada kasus pertama, Plasma substrat dibuat pada hari pengambilan darah. Pada kasus kedua, Plasma substrat dapat dibuat hingga 2 hari setelah pengambilan darah.
Plasma substrat kekurangan faktor jendal V Sebaiknya gunakan plasma yang berkekurangan bawaan atau dibuat dengan cara sebagai berikut: Pisahkan plasma dari darah manusia yang dikumpulkan dalam 0,1 bagian volume larutan natrium oksalat P 1,34% dan inkubasi pada suhu 37º selama 24 jam sampai 36 jam. Plasma ini harus mempunyai waktu jendal dari 70 detik sampai 100 detik, jika dilakukan penetapan seperti yang tertera pada penetapan kandungan dalam Larutan faktor jendal V; jika waktu jendal kurang dari 70 detik, inkubasi plasma selama 12 sampai 24 jam lagi. Simpan dalam jumlah kecil pada suhu -20º atau di bawah -20º.
Ekstrak trombokinase Ekstraksi 1,5 g Otak lembu jantan yang dikeringkan dengan aseton dalam 60 mL air pada suhu 50º selama 10 menit sampai 15 menit, sentrifus selama 2 menit pada 1500 rpm dan tuang beningan. Aktivitas ekstrak ini akan bertahan beberapa hari jika disimpan di dalam lemari pendingin. Larutan kresol P 0,03% dapat ditambahkan sebagai bakterisida.