Indikator biologik secara luas didefinisikan sebagai produk terkarakteristik dari mikroba spesifik yang resisten terhadap proses sterilisasi tertentu. Beberapa mikroorganisme yang secara luas dikenal sesuai sebagai indikator biologik adalah bakteri pembentuk spora yang secara nyata lebih resisten dibandingkan mikroflora normal, kecuali dengan proses radiasi ionisasi. Indikator biologik digunakan untuk:

·       membantu kualifikasi kinerja alat sterilisasi, dalam pengembangan dan penetapan proses sterilisasi yang tervalidasi untuk bahan tertentu.

·       proses yang menghasilkan produk steril dalam wadah atau kemasan akhir, juga untuk sterilisasi peralatan, bahan, dan komponen kemasan yang digunakan pada proses aseptik.

·       memantau siklus sterilisasi yang pernah dilakukan dan revalidasi proses sterilisasi secara berkala.

·       mengevaluasi kemampuan proses dekontaminasi isolator atau lingkungan ruang bersih.

    Prinsip dan persyaratan untuk aplikasi ini dijelaskan dalam Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas Bahan Kompendia <1371>.

JENIS INDIKATOR BIOLOGIK

    Terdapat sedikitnya tiga jenis indikator. Masing-masing jenis indikator mengandung satu jenis  spesies mikroba yang telah diketahui resistensi sterilisasinya terhadap cara sterilisasi. Beberapa indikator biologik dapat juga mengandung dua spesies yang berbedadan jumlah mikroba.

    Salah satu bentuk indikator biologik termasuk spora yang ditambahkan pada suatu pembawa (kertas saring berbentuk cakram atau strip; kaca, plastik atau bahan lain) dan dikemas sedemikian rupa agar dapat mempertahankan integritas dan viabilitas pembawa yang diinokulasi.

    Pembawa dan kemasan primer harus tidak mengandung kontaminan (fisik, kimia atau mikroba) yang akan berdampak pada kinerja atau stabilitas karakteristik dari indikator biologik. Pembawa dan kemasan primer harus tidak terdegradasi oleh proses sterilisasi tertentu, yang akan mempengaruhi kinerja indikator biologik. Pembawa harus tidak terpengaruh selama transportasi dalam kemasan primer dan sekunder serta penanganan pada saat penggunaan. Desain pembawa dan kemasan primer harus meminimalkan kehilangan inokula asli pada waktu transportasi, penanganan, dan penyimpanan selama belum kedaluwarsa.

    Bentuk lain dari indikator biologik adalah suspensi spora yang diinokulasi pada atau ke dalam unit yang mewakili bets yang disterilkan. Hal ini menunjukkan sediaan yang diinokulasi; akan tetapidapat digunakan simulasi sediaan yang diinokulasi, apabila tidak praktis untuk menginokulasi sediaan sebenarnya. Simulasi sediaan adalah sediaan yang dibuat dengan satu atau beberapa perbedaan dari sediaan yang sebenarnya, tetapi kinerjanya sama seperti sediaan bila menggunakan kondisi uji dan proses sterilisasi yang sebenarnya. Suspensi spora dengan nilai D yang telah diketahui digunakan untuk menginokulasi sediaan sebenarnya atau sediaan simulasi. Apabila digunakan sediaan simulasi  yang diinokulasi, maka harus dibuktikan bahwa itu tidak akan   menurunkan resistensi sterilisasi dari indikator biologik. Desain fisik sediaan sebenarnya atau sediaan simulasi dapat mempengaruhi resistensi suspensi spora yang diinokulasikan pada atau ke dalam sediaan. Pada kasus sediaan cair yang diinokulasi, sering disarankan untuk menetapkan kedua nilai D dan z dari mikroba indikator biologik spesifik pada sediaan cair tertentu. Bila perlu hendaknya ditentukan populasi, nilai D, nilai z dan titik akhir waktu kematian yang digunakan pada sediaan sebenarnya atau sediaan simulasi yang diinokulasi.

    Bentuk ketiga dari indikator biologik adalah indikator self-contained. Indikator biologik self-contained didesain sehingga kemasan primer yang ditujukan untuk inkubasi setelah proses sterilisasi, mengandung media pertumbuhan untuk menumbuhkan kembali mikroba yang terpapar. Bentuk indikator biologik bersama dengan media pertumbuhan self-contained dapat dianggap satu sistem. Pada kasus indikator biologik self-contained, seluruh sistem memberikan resistensi terhadap proses sterilisasi.

    Apabila indikator biologik adalah strip atau cakram kertas pada kemasan self-contained yang mengandung media kultur, bentuk kemasannya seharusnya dapat dipenetrasi oleh agen pensteril. Untuk memberikan “time lag” agar agen pensteril mencapai mikroba yang terkandung dalam sistem, nilai D, proses titik akhir waktu kematian dan waktu bertahan hidup pada sistem harus dikarakterisasi, dan hal ini tidak hanya berlaku untuk strip kertas pada unit self-contained. Setelah proses sterilisasi, strip atau cakram spora dicelupkan ke dalam media self-contained, sehingga memungkinkan kontak media dengan kultur.

    Indikator biologik self-contained juga dapat terdiri dari suspensi spora pada medianya sendiri, dan seringkali juga mengandung pewarna yang dapat menunjukkan pertumbuhan positif atau negatif setelah inkubasi. Resistensi sistem self-contained tergantung pada penetrasi dari agen pensteril ke dalam kemasan. Penetrasi dapat dikontrol oleh industri melalui berbagai desain dan komposisi dari bentuk kemasan, ampul atau wadah. Ampul yang mengandung indikator biologik self-contained dapat langsung diinkubasi setelah terpapar proses sterilisasi. Seluruh sistem kemudian diinkubasi di bawah kondisi tertentu. Ada atau tidaknya pertumbuhan spora yang diberi perlakuan ditetapkan secara visual (dengan mengamati perubahan warna tertentu dari indikator yang dimasukkan dalam media atau dengan kekeruhan) atau dengan pengamatan mikroskopik dari media yang diinokulasi.

    Karakteristik dari resistensi sistem self-contained juga harus sesuai dengan etiket dan monografi indikator biologik yang relevan. Sistem indikator biologik self-contained harus tidak terpengaruh selama transportasi dalam kemasan sekunder dan penanganan pada saat penggunaan tanpa rusak. Desain indikator biologik self-contained hendaknya sedemikian rupa sehingga meminimalkan kehilangan inokula mikroba asli selama transportasi dan penanganan. Selama atau sesudah proses sterilisasi, bahan yang digunakan dalam sistem self-contained harus tidak menyisakan atau mengeluarkan zat yang dapat menghambat pertumbuhan sejumlah kecil mikroba indikator yang bertahan hiduppada kondisi pertumbuhan. Tahapan yang tepat harus dilakukan untuk membuktikan bahwa media untuk perolehan kembali dapat mempertahankan sifat yang mendukung pertumbuhan setelah terpapar proses sterilisasi.

Penyiapan

    Seluruh kegiatan yang berhubungan dengan penyiapan indikator biologik dikendalikan dengan sistem dokumen mutu. Ketertelusuran dipelihara untuk semua bahan dan komponen yang tergabung dalam atau yang masuk kontak langsung dengan suspensi mikroba, pembawa yang diinokulasi atau indikator biologik.

    Penyiapan stok suspensi spora mikroba tertentu yang digunakan sebagai indikator biologik memerlukan pengembangan prosedur yang sesuai meliputi perbanyakan biakan, pemanenan, pemurnian, dan pemeliharaan suspensi spora. Stok suspensi harus mengandung terutama spora dorman (tidak bergerminasi) yang disimpan dalam cairan tidak bernutrisi.

    Produk akhir (suspensi mikroba, pembawa terinokulasi atau indikator biologik)  yang disediakan oleh industri harus tidak mengandung mikroba selain mikroba uji, dalam jumlah yang cukup untuk mempengaruhi produk. Sistem untuk meminimalkan keberadaan mikroba selain mikroba indikator biologik dalam produk harus divalidasi, dipantau dan dicatat.

Pemilihan Proses Sterilisasi Spesifik

    Pemilihan indikator biologik memerlukan pengetahuan resistensi sistem indikator biologik terhadap proses sterilisasi spesifik. Harus dibuktikan bahwa sistem indikator biologik memberikan suatu ketahanan terhadap proses sterilisasi yang melebihi ketahanan mikroba alami yang ada dalam atau pada produk.

    Penggunaan indikator biologik yang efektif untuk pengembangan siklus, proses, dan validasi produk dan pemantauan produksi rutin dari sebuah proses sterilisasi membutuhkan pengetahuan yang menyeluruh atas produk yang akan disterilisasi dan komponennya (bahan dan kemasan). Hanya indikator biologik yang dikenal secara luas yang disebutkan dalam monografi indikator biologik yang dapat digunakan pada pengembangan atau validasi proses sterilisasi. Hal ini menjamin bahwa indikator biologik yang dipilih memberikan ketahanan yang lebih besar terhadap proses sterilisasi dibandingkan jumlah mikroba dalam atau pada produk. Beberapa pengguna mungkin membutuhkan indikator biologik dengan karakteristik yang berbeda dari yang beredar luas secara komersial. Pada kasus seperti ini, pengguna dapat menumbuhkan kultur spora sendiri dalam penyiapan indikator biologik buatan sendiri untuk digunakan sendiri. Pada kasus seperti itu, pengguna sangat disarankan untuk menggunakan mikroba yang telah dinyatakan pada literatur ilmiah sebagai mikroba indikator dan pengguna harus mempunyai kemampuan menentukan nilai D dan z untuk indikator biologik buatan sendiri. Jika indikator biologik disiapkan sendiri, pengguna harus mengkonfirmasi populasi, kemurnian dan masa hidup indikator biologik tersebut untuk menjamin validitas setiap uji yang menggunakan indikator biologik buatan sendiri. Jika digunakan bentuk proses sterilisasi berdasarkan bioburden, data perbandingan resistensi antara indikator biologik terhadap bioburden sangat penting. Diperlukan juga penghitungan bioburden yang terkandung dalam bahan yang akan disterilkan. Proses ini harus menghasilkan kematian secara biologi terverifikasi yang mamadai untuk mencapai suatu kemungkinan diperolehnya unit nonsteril kurang dari satu dalam sejuta.

    Sebagai alternatif, metode “overkill” dapat digunakan dalam desain proses sterilisasi. Pada kasus ini, asumsi khusus dibuat berdasarkan asumsi  resistensi yang digunakan dalam menetapkan persyaratan proses sterilisasi. Secara umum, semua proses “overkill” berdasarkan asumsi bahwa “bioburden” setara dengan satu juta mikro badan yang mempunyai resistensi tinggi sehingga untuk mencapai persyaratan probabilitas dari unit nonsteril yaitu kurang dari satu dalam satu juta, minimum diperlukan proses 12 D. Proses 12 D didefinisikan sebagai proses yang memberikan kematian yang cukup untuk menghasilkan penurunan 12 log, yaitu setara dengan 12 kali nilai D terhadap mikroba dengan resistensi yang lebih tinggi dibandingkan resistensi rata-rata “bioburden”. Karena “bioburden” diasumsikan sebagai satu juta, pada praktek sesungguhnya proses “overkill” akan menghasilkan probabilitas nonsteril lebih kecil dari 10^-6. Rancangan dan evaluasi proses “overkill” dapat berbeda tergantung proses sterilisasi dalam pengujian. Penggunaan rancangan “overkill” dan pendekatan validasi dapat meminimalkan atau meniadakan kebutuhan identifikasi dan perhitungan “bioburden”.

    Panas basah  Untuk sterilisasi panas basah, spora dari strain Bacillus stearothermophilus tersedia secara komersil sebagai indikator biologik dan sering digunakan. Mikroba pembentuk spora lain yang tahan pemanasan seperti Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis,dan Bacillus coagulans juga telah digunakan dalam pengembangan dan validasi proses sterilisasi panas basah.

    Panas kering Untuk sterilisasi panas kering, spora Bacillus subtilis spp. dapat digunakan untuk validasi proses. Selama validasi proses sterilisasi panas kering, pengkajian depirogenasi endotoksin biasanya dilakukan sebagai pengganti dari pengkajian inaktifasi mikroba selama penentuan siklus sterilisasi karena kecepatan inaktifasi endotoksin tersebut lebih lambat dibandingkan kecepatan inaktifasi spora Bacillus subtilis. Pada praktek penurunan titer endotoksin oleh 3log atau lebih akan berakibat dalam proses yang juga mencapai probabilitas unit nonsteril lebih rendah dari 10^-6.

    Radiasi ionisasi  Spora Bacillus pumilus telah digunakan untuk memantau proses sterilisasi menggunakan radiasi ionisasi, akan tetapi hal ini tidak praktis.  Metode pengaturan dosis radiasi yang tidak menggunakan indikator biologik telah digunakan secara luas untuk melakukan proses radiasi. Disamping itu “bioburden” mikroba tertentu dapat menunjukkan resistensi yang lebih besar terhadap radiasi dibandingkan Bacillus pumilus.

    Etilen oksida  Untuk sterilisasi etilen oksida, biasa digunakan spora sub spesies Bacillus subtilis (Bacillus subtilis var. niger). Sistem indikator biologik yang sama pada umumnya digunakan apabila etilen oksida 100% atau etilen oksida yang berbeda dan sistem pembawa gas digunakan sebagai pensteril.

    Hidrogen Peroksida Fase Uap (“Vapor Phase Hydrogen Peroxide”/VPHP) Proses ini telah menunjukkan sebagai pensteril atau dekontaminan permukaan yang efektif.  VPHP mampu mencapai sterilisasi (probabilitas nonsteril kurang dari satu dalam satu juta) jikakondisi proses tertentu dan target yang disterilisasi disusun dengan memadai. VPHP juga biasa digunakan sebagai agen dekontaminan permukaaan pada perlakuan uji sterilitas, wadah bahan biologi atau kimia, isolator pabrik dan ruang steril.

    Dekontaminasi permukaan adalah sebuah proses yang berbeda dari sterilisasi yang mengandung bahan yang bersentuhan dengan produk, wadah sistem tertutup atau produk. Proses ini dirancang untuk memberi lingkungan yang bebas dari mikroba yang dapat terdeteksi atau yang dapat hidup kembali. Akan tetapi pada kasus dekontaminasi, nilai penurunan spora 3 sampai 4 log memadai karena sasarannya adalah lebih kepada dekontaminasi dibanding sterilisasi.

    Bacillus stearothermophilus paling banyak digunakan sebagai indikator biologik untuk validasi VPHP. Mikroba lain yang dapat digunakan sebagai indikator biologik dalam proses VPHP adalah spora dari Bacillus subtilis dan Clostridium sporogenes.  Mikroba lain dapat dipertimbangkan jika respons terhadap VPHP sama dengan mikroba yang disebutkan di atas.

    Spora dapat diinokulasi pada permukaan berbagai sistem yang kedap air seperti permukaan kaca, logam atau plastik. Permukaan dengan daya serap tinggi seperti substrat fiber, atau substrat lain yang dapat menyerap VPHP atau lembab dapat memberi pengaruh merugikan terhadap kadar VPHP untuk inaktifasi mikroba yang diinokulasi. Substrat kertas tidak digunakan karena VPHP akan mendegradasi bahan yang mengandung selulosa.

Karakteristik yang mewakili indikator biologik yang tersedia secara komersil tertera pada Tabel 1.

Indikator biologik juga dapat dikemas secara individu dalam sebuah kemasan primer terbungkus secara memadai yang tidak berpengaruh merugikan pada kinerja indikator dan dapat ditembus oleh VPHP. Bahan serat poliolefin telah terbukti sesuai sebagai pengemas indikator biologik yang dimaksudkan untuk penggunaan dalam evaluasi proses VPHP. Bahan yang sudah dikemas dapat mempermudah penanganan laboratorium untuk indikator biologik setelah paparan VPHP.

Tabel 1 Karakteristik Spesifik Sistem Indikator Biologik Komersil

^a Untuk 1,0 x 10⁶ sampai dengan 5,0 x 10⁶ spora per pembawa

^b Untuk 1,0 x 10⁶ sampai dengan 5,0 x 10⁷ spora per pembawa

^c Untuk 1,0 x 10⁶ sampai dengan 5,0 x 10⁸ spora per pembawa

Penggunaan bahan pengemas indikator biologik VPHP harus diperiksa secara cermat untuk memastikan bahwa, setelah pemaparan VPHP, hidrogen peroksida tidak tersisa pada bahan kemasan, yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba selama tahap pemulihan. Nilai D mikroba akan dipengaruhi oleh adanya efek laju inaktivasi relatif dari bahan pengemas indikator biologik dan adanya potensi sisa  VPHP. Jika digunakan indikator biologik (pembawa terinokulasi) tanpa kemasan primer, perlu diperhatikan teknik aseptik yang benar.

EVALUASI KINERJA

Tanggung Jawab Produsen

    Karakteristik kinerja dari indikator biologik yang diberikan pada pengguna merupakan tanggung jawab produsen.  Produsen hendaknya menyediakan sertifikat analisis untuk setiap lot indikator biologik yang membuktikan keabsahan pernyataan kinerja indikator biologik yang tertulis pada etiket kemasan atau dimasukkan dalam kemasan. Produsen hendaknya menjelaskan proses sterilisasi indikator biologik yang akan digunakan untuk evaluasi. Karakterisasi dari setiap jenis indikator biologik, yang menjadi dasar untuk pernyataan pada etiket, harus dilakukan oleh produsen menggunakan alat khusus dan terstandar pada  kondisi yang ditetapkan secara tepat. [1]Produsen juga hendaknya memberikan informasi mengenai nilai D, metode penentuan nilai D, jumlah mikroba dan stabilitas ketahanan indikator biologik sebelum waktu kedaluwarsa yang tertera pada etiket. Kondisi penyimpanan yang optimum hendaknya ditetapkan oleh produsen, termasuk suhu, kelembaban relatif, dan persyaratan lainnya untuk penyimpanan terkendali. Data yang diperoleh dari berbagai uji kinerja yang diperlukan hendaknya ditulis dalam sisipan kemasan atau pada etiket kemasan indikator biologik. Produsen hendaknya memberikan petunjuk penggunaan, termasuk media dan kondisi yang digunakan untuk pemulihan mikroba setelah terpapar proses sterilisasi. Cara pemusnahan harus disediakan oleh produsen indikator biologik tersebut.

Tanggung Jawab Pengguna

    Produk Komersil Jika indikator biologik dibeli dari sumber komersil, kesesuaiannya untuk penggunaan pada proses sterilisasi spesifik sebaiknya ditetapkan melalui pengkajian pengembangan proses sterilisasi kecuali jika telah tersedia data untuk penggunaan pada proses sterilisasi. Pengguna sebaiknya menetapkan sendiri kriteria keberterimaan untuk lot indikator biologik dan mempertimbangkan penolakan apabila suatu lot indikator biologik tidak mencapai standar kinerja yang telah ditetapkan. Sertifikat kinerja sebaiknya diperoleh dari masing-masing lot indikator, dan pengguna sebaiknya melakukan audit terhadap fasilitas pabrik dan kinerja prosedur secara rutin. Jika tidak diperoleh sertifikat dan audit belum dilakukan atau jika indikator biologik digunakan diluar yang dinyatakan dalam etiket dari pabrik, verifikasi dan dokumentasi kinerja pada kondisi penggunaan harus tersedia.

    Pada saat penerimaan awal indikator biologik dari pemasok komersil, pengguna sebaiknya memverifikasi kemurnian dan morfologi mikroba indikator biologik yang dibeli. Verifikasi yang diperlukan minimal sampai kebenaran genus dan juga sebaiknya dilakukan perhitungan jumlah mikroba untuk menentukan rata-rata tiap unit indikator biologik. Pernyataan pabrik yang berkaitan dengan rentang nilai D, kondisi penyimpanan, waktu kedaluwarsa, dan stabilitas indikator biologik sebaiknya diperhatikan dan dicatat. Pengguna dapat mempertimbangkan untuk melakukan penilaian nilai D sebelum menerima lot tertentu. Laboratorium yang mempunyai kemampuan melakukan pengujian kinerja nilai D dapat melakukan penentuan nilai D menggunakan satu dari tiga metode yang tertera pada Penetapan Nilai D dalam Uji Kinerja Resistensi Indikator Biologik <65> dan pada monografi yang sesuai untuk indikator biologik khusus. Jika dilakukan penyimpanan dalam jangka waktu lama perlu dilakukan verifikasi nilai D dan sistem perhitungan stabilitas indikator biologik yang digunakan.

    Pada keadaan dimana spora dipelihara lebih dari 12 bulan di bawah kondisi penyimpanan yang terdokumentasi, harus dilakukan analisis jumlah dan resistensi spora, kecuali jika kinerja panenan induk asli telah tervalidasi untuk penyimpanan yang lebih lama. Hasil uji angka spora dan resistensi sebaiknya berada dalam rentang keberterimaan yang ditetapkan selama penerimaan awal dari lot panenan spora.

    Produk Nonkomersil  Pengguna dapat memilih untuk memperbanyak mikroba dalam pengembangan indikator biologik buatan sendiri untuk pengembangan atau validasi proses sterilisasi. Jika pengguna membuat indikator biologik, persyaratan kinerja indikator biologik harus dipenuhi. Jika sistem indikator biologik digunakan untuk pengembangan proses sterilisasi baru atau validasi proses yang sudah ada, kriteria kinerja yang sama seperti dijelaskan untuk pabrik komersil indikator biologik harus dipenuhi.

PERSIAPAN PANENAN SPORA

    Umumnya indikator biologik menggunakan spora mikroba, oleh karena itu rekaman yang akurat tentang identifikasi panenan spora harus didokumentasikan oleh pabrik indikator biologik komersil dan nonkomersil. Rekaman ini sebaiknya mencakup rekaman yang berkaitan dengan sumber awal kultur, identifikasi, ketertelusuran pada panenan spora induk, frekuensi subkultur, media yang digunakan untuk sporulasi, perubahan penyiapan media, pengamatan kontaminasi panenan, dan data sebelum dan sesudah pemanasan ekstrim. Rekaman pemakaian panen spora dan resistensi terhadap sterilisasi (yaitu nilai D dan nilai z jika memungkinkan) sebaiknya juga didokumentasikan.

Peralatan

    Peralatan yang digunakan untuk evaluasi resistensi sterilisasi panenan spora harus konsisten dengan standar yang ada yang berhubungan dengan evaluasi kinerja sistem indikator biologik.

    Peralatan untuk penetapan nilai D mikroba yang terpapar VPHP sebaiknya dapat mengendalikan secara ketat parameter operasional lain dari yang tertera pada Uji Kinerja Resistensi Indikator Biologik <65>. Perlu diperhatikan jaminan kemampuan menghasilkan kadar VPHP secara konsisten, diberikan dalam waktu yang terbatas, dan dipertahankan dalam rentang kadar tertentu atau rentang tekanan VPHP untuk menetapkan penambahan waktu yang diperlukan. Indikator biologik yang dimasukkan dalam kadar yang tetap pada kondisi VPHP sebaiknya melalui suatu sistem yang memungkinkan pemasukan dan pelepasan unit kerja secara cepat dari ruangan. Rancangan ruang uji sebaiknya memungkinkan pencapaian kadar dan tekanan VPHP yang tetap, atau penggunaan jumlah tertentu volume VPHP yang mengalir pada tekanan  dan suhu yang ditetapkan. Saat ini, peralatan pengukur kadar VPHP tidak digunakan secara luas. Oleh karena itu, kondisi pemaparan perlu didasarkan pada tekanan VPHP tetap atau hasil laju alir dari berat awal hidrogen peroksida yang telah diketahui,  ditambahkan ke dalam ruangan dalam waktu tertentu. Berdasarkan informasi ini, volume tertentu ruangan yang telah diketahui, perhitungan perkiraan kadar VPHP dapat dilakukan. Jika keseluruhan kondisi dipertahankan secara tetap selama penilaian masing-masing nilai D yang digunakan, perbandingan resistensi relatif antara lot indikator biologik yang berbeda dapat ditentukan. 

PENGGUNAAN DALAM PROSES VALIDASI

    Tanpa memperhatikan cara sterilisasi, jumlah populasi mikroba awal, resistensinya terhadap sterilisasi dan tempat inokulasi pada atau di dalam produk dapat mempengaruhi kecepatan inaktifasi indikator biologik.

    Pada produk yang mengandung mikroba tantang, beberapaposisi dari produk sebaiknya diinokulasi dengan indikator biologik. Sebagai contoh, jika sebuah wadah dengan sistem tertutup disterilisasi, larutan produk dan penutupnya dapat ditantang untuk menjamin sterilisasi  sebanding dengan 10^-6 (probabilitas unit nonsterilsatu dalam satu juta) tingkat jaminan sterilisasi (Sterilization Assurance Level, SAL) akan diperoleh pada larutan dan juga pada penutup.

    Sebelumnya perlu dilakukan pengkajian laboratorium apakah komponen produk lebih sulit untuk disterilisasi daripada sediaannya. Tergantung pada lokasi komponen produk yang paling sulit untuk disterilisasi, parameter proses yang berbeda dapat diterapkan dalam menjamin inaktifasi mikroba terhadap 10^-6 SAL. Fase kualifikasi kinerja produk hendaknya mengidentifikasi paramater proses yang penting untuk inaktifasi mikroba pada bagian yang paling sulit untuk disterilkan. Jika parameter proses yang pentingini telah ditetapkan, selama sterilisasi pada proses validasi produk, sebaiknya dioperasikan pada kondisi kurangdari kondisi yang dinyatakan pada spesifikasi proses sterilisasi. Kelangsungan hidup indikator biologik didasarkan pada resistensi dan populasi. Sehingga, 10^-6 populasi indikator biologik tidak selalu dipersyaratkan untuk menghasilkan 10^-6 SAL. Penggunaan indikator biologik yang semestinya adalah menggunakannya untuk mengkonfirmasi bahwa hasil parameter proses yang dikembangkan berada dalam SAL yang diinginkan.  Pada sterilisasi basah, indikator biologik digunakan untuk membuktikan bahwa kematian yang terukur secara fisik dapat diverifikasi secara biologi. Indikator biologik dengan nilai D yang sebenarnya dan populasi yang sebenarnya kurang dari 10⁶ cukup untuk validasi beberapa proses sterilisasi dan dekontaminasi. Penting bahwa pengguna dapat menetapkan pemilihan indikator biologik secara ilmiah.

[1]Tertera pada Peralatan dalam Uji Kinerja Resistensi Indikator Biologik <65>. Peralatan ini telah dirancang untuk memberikan kondisi fisik yang konsisten dan dapat diaplikasikan terhadap karakterisasi indikator biologik. Harus dinyatakan karakteristik kinerja yang diperlukan.