Manifestasi utama dari aktivitas insulin, yaitu menurunkan kadar gula darah secara tiba-tiba yang merupakan dasar untuk penetapan biologis potensi insulin. Prosedur penetapan walaupun relatif tidak praktis, mempunyai nilai yang besar karena secara akurat menggambarkan dengan tepat efek pada penderita diabetes. Adanya metode fisikokimia yang canggih (misalnya kromatografi cair) merupakan uji secara kuantitatif yang memiliki tingkat akurasi dan presisi tinggi untuk mengukur potensi insulin dan sediaan insulin.Walaupun metode ini canggih tetapi tidak dapat menggambarkan bioidentitas insulin dan sediaan insulin tersebut. Selanjutnya uji kualitatif pada kelinci dimasukkan dalam bab ini dan penggunaannya ada dalam setiap monografi yang sesuai.

    Metode kuantitatif gula darah kelinci digunakan untuk penetapan potensi baku pembanding insulin, untuk validasi stabilitas sediaan insulin baru dan untuk penetapan aktifitas spesifik dari analog insulin.

Metode Kuantitatif Gula Darah Kelinci

Baku pembanding Dekstrosa BPFI, bentuk anhidrat dari dektrosa; keringkan pada suhu 105º selama 16 jam sebelum digunakan, simpan dalam wadah tertutup rapat. Insulin BPFI; simpan pada suhu tidak lebih dari -15º. Setelah vial dibuka, tanpa penundaan, pindahkan secara saksama isi vial ke dalam labu tentukur kering dan bersih yang sesuai. Tutup rapat labu, simpan dalam lemari pembeku. Tidak boleh dikeringkan sebelum digunakan untuk uji atau penetapan kadar. Insulin Manusia BPFI; simpan dalam lemari pendingin pada suhu antara -20º dan -18º. Setelah vial dibuka tanpa penundaan, pindahkan secara saksama isi vial ke dalam labu tentukur kering dan bersih yang sesuai. Tutup rapat labu, simpan dalam lemari pembeku. Tidak boleh dikeringkan sebelum digunakan untuk uji atau penetapan kadar. Insulin (sapi) BPFI; tidak boleh dikeringkan. Simpan dalam lemari pembeku pada suhu antara -20º dan -18º, dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya dan kelembaban. Insulin (babi) BPFI; tidak boleh dikeringkan, simpan dalam lemari pembeku pada suhu antara -20º dan -18º. Setelah dibuka, simpan dalam wadah tertutup rapat, lindungi dari cahaya dan kelembaban.

Pengencer Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, siapkan larutan dalam air mengandung kresol P atau fenol P 0,1% - 0,25% (b/v), gliserin P 1,4% - 1,8% (b/v), atur pH hingga  antara 2,5 dan 3,5 dengan penambahan asam hidroklorida P.

Larutan baku persediaan Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, larutkan secara kuantitatif sejumlah Insulin BPFI yang ditimbang saksama atau satu vial beku kering Insulin BPFI, dari spesies yang sesuai dalam Pengencer untuk membuat larutan baku persediaan yang mengandung 40 unit Insulin FI per mL dan mempunyai pH antara 2,5 dan 3,5. Simpan di tempatdingin, hindaridari pembekuan dan gunakan dalam waktu 6 bulan.

Larutan baku Encerkan sejumlah Larutan baku persediaan dengan Pengencer untuk membuat dua larutan, masing-masing mengandung 1,0 unit Insulin FI per mL (larutan baku 1) dan 2,0 unit Insulin FI per mL (larutan baku 2).

Larutan uji persediaan Lakukan seperti tertera pada Larutan baku persediaan, kecuali menggunakan sejumlah zat uji sebagai pengganti Insulin BPFI. Larutan mengandung lebih kurang 40 unit Insulin FI per mL.

Larutan uji Encerkan sejumlah Larutan uji persediaan dengan Pengencer untuk membuat dua enceran uji, berdasar kanpotensi yang diasumsikan, mengandung 1,0 unit Insulin FI per mL (Larutan Uji 1) dan 2,0 unit Insulin FI per mL (LarutanUji 2). Jika injeksi insulin netral, atur pH antara 2,5 dan 3,5  sebelum membuat enceran.

Dosis enceran yang akan disuntikkan Pilih dosis enceran yang akan disuntikkan berdasarkan percobaan atau pengalaman, umumnya volume antara 0,30 mL dan 0,50 mL. Untuk masing-masing hewan volume Larutan baku sama dengan Larutan uji.

Penyiapan hewan uji Pilih kelinci sehat yang sesuai dengan bobot tubuh tidak kurang dari 1,8 kg. Kelinci diaklimatisasi di laboratorium selama tidak kurang dari 1 minggu sebelum digunakan,  pelihara dengan pakan yang seragam dan air tersedia sepanjang waktu.

Prosedur Kelinci dibagi 4 kelompok yang sama dengan tidak kurang dari 6 pada setiap kelompok. Pada hari sebelumnya, lebih kurang 20 jam sebelum penetapan, sediakan sejumlah pakan untuk masing-masing kelinci yang akan dikonsumsi dalam waktu 6 jam. Ikuti jadwal pemberian makan setiap hari pengujian. Selama pengujian, puasakan kelinci sampai seluruh pengambilan specimen darah selesai. Perlakukan kelinci secara hati-hati untuk mencegah kegelisahan, dan suntik secara subkutan sejumlah dosis yang ditetapkan sesuai rancangan (lihat Tabel 1), penyuntikkan kedua dilakukan pada hari berikutnya, atau tidak lebih dari 1 minggu kemudian. Waktu antara injeksi pertama dan kedua adalah sama untuk setiap kelinci.

Tabel 1

Contoh darah Pada 1 jam ± 5 menit dan 2,5 jam ± 5 menit setelah penyuntikan, ambil specimen darah dari setiap kelinci melalui vena tepi telinga atau lebih efektif dari arteri aurikularis.

Penetapan dekstrosa Tetapkan kandungan dekstrosa dari specimen darah dengan prosedur yang sesuai yang diadaptasi dengan analisis secara otomatis. Prosedur dibawah ini dapat digunakan.

    Larutan antikoagulan Larutkan 1 g natrium EDTA dan 200 mg natrium fluorida dalam 1 liter air, campur.

    Larutan baku dekstrosa Pindahkan sejumlah Dekstrosa BPFI yang diketahui kadarnya kedalam labu tentukur yang sesuai dan encerkan secara kuantitatif dan bertahap dengan Larutan antikoagulan (1:9) untuk mendapatkan rentang kadar antara 20 dan 100 mg per  100 mL, yang diketahui sama dengan kadar pada sampel darah kelinci.

    Larutan uji Pipet secara terpisah 0,1 mL setiap sampel darah, masukkan ke dalam tabung reaksi dan tambahkan 0,9 mL Larutan antikoagulan.

    Prosedur Lakukan dialisa Larutan uji melalui membran semipermeable dalam waktu yang cukup sehingga dekstrosa melewati membran masuk ke dalam larutan salin LP yang mengandung glukosa oksidase, “horseradish peroxidase”, 3-metil-2-benzotiazolinon hidrazon hidroklorida LP, dan N,N-dimetilanilin. Tetapkan serapan Larutan Uji pada  600 nm pada kolorimeter. Lakukan penetapan serupa terhadap serapan Larutan Baku Dekstrosa pada awal dan akhir setiap penetapan.

Perhitungan Hitung respons setiap kelinci pada tiap penyuntikan dari jumlah 2 nilai gula darah, dan kurangi respons tanpa memperhatikan urutan kronologis respons yang diamati, untuk memperoleh perbedaan individu, y, seperti yang dijelaskan pada Tabel 2.

Jika data dari satu atau lebih kelinci hilang pada penetapan, jangan gunakan rumus interval kepercayaan yang tertera, tapi gunakan rumus statistik lain. Data tetap dapat dianalisa menggunakan analisa variansi yang sesuai.

Jika jumlah kelinci, f,  dilakukan melalui penetapan yang sama dalam setiap kelompok, jumlah y’s dalam setiap kelompok dan hitung T_a   = –T₁ + T ₂ + T ₃ –T₄ dan T_b =  T₁ + T ₂ + T ₃ +T_{4 .}Logaritma potensi relatif dari enceran uji adalah M? = 0,301 T_a /T_{b .}Potensi injeksi dalam Unit per mg setara dengan antilog (log R + M?), dimana R = v_s/v_u, v_s adalah jumlah unit per mL Larutan Baku dan v_u adalah jumlah mg insulin per mL yang sesuai LarutanUji.

Tetapkan rentang kepercayaan 95% untuk log potensi relatif menggunakan teori Fieller’s (lihat Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>). Jika rentang kepercayaan lebih dari 0,082, yang sesuai pada P = 0,95 dengan batas kepercayaan lebih kurang 10% dari potensi yang dihitung, ulangi pengujian hingga gabungan data  dari dua atau lebih penetapan, tetapkan kembali seperti tertera pada Kombinasi dari Penetapan yang Berdiri Sendiri dalam Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>, memenuhi batas yang dapat diterima.

Tabel 2

Lampiran

Teori Fieller untuk Penetapan Rentang Kepercayaan Perbandingan 

Versi Teori Fieller ini digunakan bila pembilang dan penyebut tidak saling berhubungan. Asumsi persamaan pembilang dan penyebut terdistribusi normal dan kelompok kelinci ukurannya sama.

Selanjutnya rentang kepercayaan 95% untuk rasio adalah:

f adalah derajat kebebasan pada standard errors = 4(k-1), k adalah jumlah kelinci pada setiap kelompok; t adalah persentil atas 97,5 dari distribusi t dengan derajat kebebasan f dan

Jika g ? 1, penyebut tidak berbeda signifikan dari 0 sehingga rumus tidak dapat dipakai,

UJI BIOIDENTITAS 

Lakukan seperti pada Metode Kuantitatif Gula Darah Kelinci dengan modifikasi sebagai berikut :

Prosedur Kelinci dibagi dalam 4 kelompok yang sama, masing-masing kelompok 2 kelinci.

Perhitungan Lakukan perhitungan seperti pada Metode Kuantitatif Gula Darah Kelinci, tetapi tidak menetapkan rentang kepercayaan dari log potensi relatif, M?.

Interpretasi hasil Jika nilai potensi yang diperoleh adalah tidak kurang dari 15 unit FI per mg, persyaratan Uji bioidentitas terpenuhi. Jika nilai potensi kurang dari 15 unit FI per mg, ulangi pengujian dengan menggunakan 8 kelinci lebih dari jumlah awal. Jika potensi rata-rata dari 2 kumpulan uji kurang dari 15 unit FI per mg, persyaratan uji terpenuhi.