Uji 1

    Cara ini digunakan untuk penetapan vitamin A dalam sediaan farmasi. Lakukan penetapan secepat mungkin, upayakan seminimum mungkin dari pengaruh cahaya, oksigen dari udara dan zat pengoksidasi lain, sebaiknya menggunakan alat kaca aktinik rendah dan gas inert.

    Jika mengandung tokoferol, metode kromatografi yang sesuai harus digunakan.

    Larutan uji Timbang saksama, hitung, atau ukur secara saksama sejumlah zat uji setara dengan tidak kurang dari 0,15 mg retinol tetapi tidak boleh mengandung lemak lebih dari 1 g. Bila berbentuk kapsul, tablet atau bentuk padat lainnya yang tidak dapat disabunkan secara efisien dengan cara yang diberikan, refluks dalam 10 mL air di atas tangas uap selama lebih kurang 10 menit, hancurkan bagian padat yang masih tertinggal dengan batang pengaduk kaca tumpul, hangatkan selama lebih kurang 5 menit lagi.

    Masukkan ke dalam labu kaca borosilikat yang sesuai, tambahkan 30 mL etanol P, dan 3 mL larutan kalium hidroksida P (9 dalam 10). Refluks dalam alat yang keseluruhannya terbuat dari kaca borosilikat selama 30 menit. Dinginkan larutan, tambahkan 30 mL air, masukkan ke dalam corong pisah. Tambahkan 4 g serbuk halus natrium sulfat dekahidrat P. Ekstraksi satu kali dengan 150 mL eter P, kocok selama 2 menit, bila terbentuk emulsi, ekstraksi lagi 3 kali, tiap kali dengan 25 mL eter P. Gabungkan ekstrak eter, bila perlu bilas dengan 50 mL air dengan menggoyang perlahan-lahan. Ulangi pembilasan tiga kali, tiap kali dengan 50 mL air dengan menggoyang lebih kuat. Pindahkan ekstrak eter yang telah dibilas ke dalam labu tentukur 250-mL, tambahkan eter P sampai tanda.

    Pipet 25 mL ekstrak eter ke dalam labu yang sesuai uapkan hingga lebih kurang 5 mL. Tanpa pemanasan dan dengan bantuan aliran gas inert atau hampa udara, lanjutkan penguapan hingga lebih kurang 3 mL. Larutkan residu dalam isopropanol P secukupnya hingga kadar vitamin A setara 3 µg sampai 5 µg per mL atau memberikan serapan dalam rentang 0,5 hingga 0,8 pada panjang gelombang 325 nm.

    Prosedur Ukur serapan larutan pada panjang gelombang 310 nm, 325 nm dan 334 nm menggunakan sel kuarsa 1-cm dan gunakan isopropanol P sebagai blangko. Hitung kadar Vitamin A, sebagai kadar retinol, C₂₀H₃₀O dalam mg dengan rumus:

atau

L adalah panjang sel, dalam cm; C adalah kadar larutan uji dalam g, kapsul atau tablet dalam tiap 100 mL larutan akhir isopropanol; [A₃₂₅] adalah serapan pada 325 nm yang telah dikoreksi dengan rumus:

    Tiap mg vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O, setara dengan 3333 unit Vitamin A FI.

    Gunakan rumus pertama dimana A₃₂₅ serapan pada 325 nm, mempunyai harga antara [A₃₂₅]/1,030 dan [A₃₂₅]/0,970. Gunakan rumus kedua dimana [A₃₂₅] mempunyai harga kurang dari A₃₂₅/1,030.

[Catatan Rentang batas kesalahan yang menunjukkan tingkat ketidaksesuaian yang diharapkan pada hasil dari laboratorium yang berbeda pada P = 0,05, adalah kira-kira ± 8%.]

Uji 2

    Cara ini digunakan untuk penetapan ester retinil murni atau disiapkan dari ester retinil murni menjadi eksipien dalam sediaan farmasi.

    Timbang saksama 25-100 mg, larutkan dalam 5 mL pentana P dan encerkan dengan isopropanol P hingga kadar vitamin A setara dengan kadar retinol 3-4,5 mg per mL. Ukur serapan larutan pada panjang gelombang 326 nm menggunakan sel kuarsa 1-cm dan gunakan isopropanol P sebagai blangko. Hitung kadar vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O dalam mg dengan rumus:

A₃₂₆ adalah serapan pada 326 nm ; L adalah panjang sel, dalam cm; C adalah kadar larutan uji dalam g dalam tiap 100 mL.

    Tiap mg vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O, setara dengan 3333 unit vitamin A FI.

METODE KROMATOGRAFI

    Prosedur kromatografi cair kinerja tinggi berikut digunakan untuk penetapan vitamin A dalam sediaan farmasi. Lakukan prosedur berikut, lindungi seluruh larutan yang mengandung dan berasal dari larutan uji dan baku pembanding dari udara dan cahaya, sebaiknya menggunakan gas inert dan alat kaca aktinik rendah.

    Jika pada prosedur disebutkan menggunakan ester vitamin A (retinil asetat atau retinil palmitat), gunakan sesuai bentuk kimia yang ada dalam bahan baku.

    Baku pembanding Retinil Asetat BPFI (Vitamin Asetat BPFI); Pada saat digunakan, gunting ujung kapsul, keluarkan dan timbang larutan. Buang bagian yang tidak digunakan setelah kapsul dibuka. Simpan dalam wadah tertutup rapat, simpan pada tempat dingin dan kering atau pada lemari pendingin, lindungi dari cahaya. [Catatan Gunakan Vitamin A BPFI, semua bentuk trans retinil asetat, untuk penetapan bentuk sediaan farmasi yang pada etiket mencantumkan mengandung retinol atau ester Vitamin A (retinil asetat atau retinil palmitat)]. Retinil Palmitat BPFI; tidak boleh dikeringkan sebelum digunakan, simpan dalam lemari pendingin, terlindung cahaya.

Uji 1

    Cara ini merupakan prosedur netral dengan cara melarutkan sampel langsung ke dalam heksan P dan menyuntikkan ke dalam kromatograf cair atau ekstraksi sampel dengan terlebih dahulu  melarutkan sampel dalam dimetil sulfoksida P, dan lakukan ekstraksi cair-cair untuk vitamin A menggunakan heksan P. Meskipun metode kromatografi dapat memisahkan bentuk 13-cis dan semua isomer trans vitamin A, tetapi hanya puncak semua isomer trans yang digunakan untuk menghitung vitamin A. Prosedur ini dapat digunakan untuk menentukan vitamin A dalam bahan baku, tablet vitamin larut minyak, kapsul vitamin larut minyak, tablet vitamin larut air dan minyak, kapsul vitamin larut air dan minyak, tablet vitamin dengan mineral larut air dan minyak, kapsul vitamin dengan mineral larut air dan minyak.

    Kecuali dinyatakan lain dalam monografi, Larutan baku, Larutan uji dan Larutan kesesuaian sistem dibuat sebagai berikut:

    Fase gerak Gunakan n-heksan P.

    Larutan baku 1 Timbang saksama sejumlah Vitamin A Asetat BPFI, larutkan dalam n-heksana P, jika perlu encerkan secara bertahap dan kuantitatif hingga kadar retinol lebih kurang 15 µg per mL. [Catatan 1 mg retinil asetat setara dengan 0,872 mg retinol.]

    Larutan baku 2 Timbang saksama sejumlah Retinil Palmitat BPFI, larutkan dalam n-heksana P, jika perlu encerkan secara bertahap dan kuantitatif hingga kadar retinol lebih kurang 15 µg per mL. [Catatan 1 mg retinil palmitat setara dengan 0,546 mg retinol.]

    Larutan kesesuaian sistem Campur sejumlah volume sama Larutan baku 1 dan Larutan baku 2.

    Larutan uji untuk bahan baku Timbang saksama sejumlah retinil asetat atau retinil palmitat setara dengan 15 mg retinol, masukkan ke dalam labu tentukur 100-mL, larutkan dan encerkan dengan n-heksan P sampai tanda, dan kocok. Pipet 5 mL larutan ini ke dalam labu tentukur 50-mL encerkan dengan n-heksana P sampai tanda, dan kocok.

    Larutan uji tablet Timbang dan serbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Pindahkan sejumlah serbuk tablet tidak lebih dari 7,5 g, setara dengan tidak kurang dari 1 mg vitamin A, sebagai retinol (C₂₀H₃₀O), ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir berlapis polytef. Tambahkan 2 mL dimetil sulfoksida P dan 3 mL n-heksan P per g serbuk tablet, kocok selama 45 menit pada tangas air pada suhu 60°. [Catatan Atur pengocok untuk memastikan bahwa campuran dalam tabung tercampur dengan sempurna dan menyeluruh.] Sentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, dan pindahkan lapisan heksan ke dalam labu tentukur. Tambahkan 3 mL n-heksan P per g serbuk tablet ke dalam lapisan dimetil sulfoksida P, kocok kuat selama 5 menit, pindahkan lapisan heksan ke dalam labu tentukur yang sama. Ulangi ekstraksi dengan penambahan 3 bagian n-heksan P. Encerkan ekstrak dengan n-heksan P dalam labu tentukur sampai tanda. Encerkan volume larutan ini dengan n-heksan P untuk mendapatkan kadar 15 mg per mL vitamin A, sebagai retinol (C₂₀H₃₀O). [Catatan Pengenceran mungkin tidak diperlukan.] 

    Larutan uji kapsul Pindahkan tidak kurang dari 20 isi kapsul ke dalam wadah yang sesuai, aduk, dan timbang. Pindahkan sejumlah campuran tidak lebih dari 7,5 g, setara dengan tidak kurang dari 1 mg vitamin A, sebagai retinol (C₂₀H₃₀O), ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir berlapis polytef [Catatan Untuk kapsul gelatin keras, buang bagian yang tidak digunakan, buka cangkang kapsul tidak kurang dari 20 kapsul, pindahkan kapsul dan masukkan ke dalam wadah yang sesuai, dan gerus hingga terbentuk massa yang homogen. Pindahkan sebagian massa, setara tidak kurang dari 1 mg vitamin A, sebagai retinol (C₂₀H₃₀O) ke dalam tabung sentrifuga bertutup ulir berlapis polytef.] Tambahkan 2 mL dimetil sulfoksida P dan 3 mL n-heksan P per g isi kapsul, kocok selama 45 menit pada tangas air pada suhu 60°. [Catatan Atur pengocok untuk memastikan bahwa campuran dalam tabung tercampur dengan sempurna dan menyeluruh.] Sentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, dan pindahkan lapisan heksan ke dalam labu tentukur. Tambahkan 3 mL n-heksan P per g isi kapsul kedalam lapisan dimetil sulfoksida P, kocok kuat selama 5 menit, pindahkan lapisan heksan P ke dalam labu tentukur yang sama. Ulangi ekstraksi dengan penambahan 3 bagian n-heksan P. Encerkan ekstrak dengan n-heksan P dalam labu tentukur sampai tanda. Encerkan volume larutan ini dengan n-heksan P untuk mendapatkan kadar 15 mg per mL vitamin A, sebagai retinol (C₂₀H₃₀O). [Catatan Pengenceran mungkin tidak diperlukan.]

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan secara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 325 nm dan kolom 4,6 mm x 15 cm, berisi bahan pengisi L8 dengan ukuran partikel 3 µm. Laju alir lebih kurang 1 mL per menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan kesesuaian sistem, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara semua bentuk trans retinil asetat dan semua bentuk trans retinil palmitat tidak kurang dari 10. Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku 1 atau Larutan baku 2, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang Larutan baku 1 atau Larutan baku 2 tidak lebih dari 3,0%.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 40 µl) Larutan baku 1 atau Larutan baku 2 dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram, ukur respons puncak utama. Hitung persentase, vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O_, dalam bagian vitamin A yang digunakan dengan rumus:

r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak dari semua bentuk ester retinil Larutan uji dan Larutan baku 1 atau Larutan baku 2; C_S adalah kadar retinol, C₂₀H₃₀O dalam µg per mL Larutan baku 1 atau Larutan baku 2; dan C_U adalah kadar vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan jumlah yang tertera pada etiket.

Uji 2

    Prosedur ini dilakukan dengan mencampurkan zat uji dengan asam sulfat metanolat, ekstraksi dengan 2,2,4-trimetilpentana P. Persiapan sampel dapat digunakan untuk formulasi yang mengandung vitamin A, D dan E. Termasuk juga tablet vitamin larut minyak, kapsul vitamin larut minyak, tablet vitamin larut air dan minyak, kapsul vitamin larut air dan minyak, tablet vitamin dengan mineral larut air dan minyak dan kapsul vitamin dengan mineral larut air dan minyak.

    Kecuali dinyatakan lain dalam monografi, Larutan baku, Larutan uji, Larutan kesesuaian sistem dan Pereaksi dibuat sebagai berikut:

    Fase gerak Campuran n-heksan P-etil asetat P (99,7:0,3).

    Larutan asam sulfat metanolat 3 N Tambahkan 9 mL asam sulfat P ke dalam 80 mL metanol P dalam labu tentukur 100 mL dengan hati-hati. Dinginkan dan encerkan dengan metanol P sampai tanda.

    Larutan natrium askorbat-pirogalol Masukkan 10 g natrium askorbat P dan 5 g pirogalol P ke dalam labu tentukur 100 mL, tambahkan air secukupnya hingga terlarut. Tambahkan 1,7 mL asam sulfat P dan encerkan dengan air sampai tanda.

    Larutan lesitin Timbang saksama sejumlah lesitin P, larutkan dan encerkan dengan 2,2,4-trimetilpentana P hingga kadar lebih kurang 5 mg per mL.

    Larutan baku 1 Timbang saksama sejumlah Retinil Asetat BPFI, larutkan dalam 2,2,4-trimetilpentana P, hingga kadar retinol lebih kurang 15 µg per mL.

    Larutan baku 2 Timbang saksama sejumlah Retinil Palmitat BPFI, larutkan dalam 2,2,4-trimetilpentana P, hingga kadar retinol lebih kurang 15 µg per mL.

    Larutan kesesuaian sistem Campur sejumlah volume sama Larutan baku 1 dan Larutan baku 2.

    Larutan uji tablet [Catatan Persiapan ini dapat digunakan untuk menentukan vitamin A, vitamin D dan vitamin E yang terdapat dalam formulasi. Jumlah sampel dapat disesuaikan dengan serapan dari vitamin tertentu.] Timbang dan serbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Pindahkan sejumlah serbuk tablet setara dengan antara 0,4 mg dan 2,5 mg retinol. Tambahkan 0,5 g natrium bikarbonat P, 1,5 mL Larutan lesitin dan 12,5 mL 2,2,4-trimetilpentana P, dispersikan menggunakan vortex. Tambahkan 6 mL Larutan natrium askorbat-pirogalol, kocok perlahan, dan awaudarakan. Lanjutkan pengocokan selama 12 menit. Tambahkan 6 mL dimetil sulfoksida P, vortex hingga membentuk suspensi, kocok selama 12 menit. Tambahkan 6 mL Larutan asam sulfat metanolat 3 N, vortex hingga membentuk suspensi dan kocok selama 12 menit. Tambahkan 12,5 mL 2,2,4-trimetilpentana P, vortex hingga membentuk suspensi, kocok selama 10 menit. Sentrifus selama 10 menit untuk memisahkan larutan emulsi dan beningan. Jika diperlukan, larutkan beningan dengan 2,2,4-trimetilpentana P hingga mendekati kadar Larutan baku.

    Larutan uji kapsul [Catatan Persiapan ini dapat digunakan untuk menentukan vitamin A, vitamin D dan vitamin E yang ada dalam formulasi. Jumlah sampel dapat disesuaikan dengan serapan dari vitamin tertentu.] Timbang tidak kurang dari 20 kapsul ke dalam botol timbang yang telah ditara. Gunakan pemotong tajam jika diperlukan, buka kapsul hati-hati, tanpa kehilangan bagian cangkang, pindahkan isi ke dalam gelas piala 100 mL. Cuci dengan eter P untuk hilangkan semua isi yang masih menempal pada cangkang kapsul. Buang hasil cucian dan keringkan cangkang kapsul dengan bantuan aliran udara. Timbang berat cangkang kapsul kosong ke dalam botol timbang yang telah ditara dan hitung berat bersih isi kapsul. Timbang sejumlah isi kapsul, setara dengan lebih kurang 2,5 mg vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O berdasarkan yang tertera pada etiket. Tambahkan 0,5 g natrium bikarbonat P; 1,5 mL Larutan lesitin; 12,5 mL 2,2,4-trimetilpentana P, dan vortex. Tambahkan 6 mL Larutan natrium askorbat-pirogalol, kocok perlahan, dan awaudarakan. Lanjutkan pengocokan selama 12 menit. Tambahkan 6 mL dimetil sulfoksida P, vortex hingga membentuk suspensi, kocok selama 12 menit. Tambahkan 6 mL Larutan asam sulfat metanolat 3 N, vortex hingga membentuk suspensi, kocok selama 12 menit. Tambahkan 12,5 mL 2,2,4-trimetilpentana P, vortex hingga membentuk suspensi, kocok selama 10 menit. Sentrifus selama 10 menit untuk memisahkan larutan emulsi dan beningan. Jika diperlukan, larutkan beningan dengan 2,2,4-trimetilpentana P hingga mendekati kadar Larutan baku.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan secara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 325 nm dan kolom 4,6 mm x 25 cm, berisi bahan pengisi L24 dengan ukuran partikel 5 µm. Laju alir lebih kurang 1,5 mL per menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan kesesuaian sistem, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: resolusi, R, antara semua bentuk trans retinil asetat dan semua bentuk trans retinil palmitat tidak kurang dari 8,0; simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 3,0%.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 40 µl) Larutan baku 1 atau Larutan baku 2 dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. Hitung persentase, vitamin A sebagai retinol, C₂₀H₃₀O_, dalam bagian vitamin A yang digunakan dengan rumus:

r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak dari semua bentuk trans ester retinil Larutan uji dan Larutan baku 1 atau Larutan baku 2; C_S adalah kadar retinol, C₂₀H₃₀O dalam µg per mL Larutan baku 1 atau Larutan baku 2; dan C_U adalah kadar vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan jumlah yang tertera pada etiket. [Catatan Gunakan 26,5 mL volume akhir Larutan uji untuk menghitung kadar nominal.]

Uji 3

    Pada prosedur ini dilakukan penyabunan baku pembanding dan zat uji, dilanjutkan dengan ekstraksi cair-cair vitamin A dengan campuran n-heksan P-metilen klorida P (3:1). Bentuk 13-cis dan semua bentuk trans isomer vitamin A dapat dikarakterisasi dan dihitung. Prosedur ini dapat digunakan untuk tablet vitamin larut minyak, kapsul vitamin larut minyak, tablet vitamin larut air dan minyak, kapsul vitamin larut air dan  minyak, tablet vitamin dengan mineral larut air dan minyak, kapsul vitamin dengan mineral larut air dan minyak.

    Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, Larutan baku, Larutan uji dan Pereaksi dibuat sebagai berikut:

    Fase gerak Campuran n-heksan P-isopropanol P (92:8).

    Pelarut ekstraksi Campuran n-heksan P-metil klorida P (3:1).

    Larutan kalium hidroksida Timbang saksama sejumlah kalium hidroksida P, larutkan dan encerkan dengan air hingga kadar lebih kurang 800 mg per mL. [Catatan Hati-hati memasukkan kalium hidroksida P ke dalam air, campur dan dinginkan.]

    Pengencer Timbang saksama sejumlah pirogalol P larutkan dan encerkan dengan etanol P hingga kadar lebih kurang 10 mg per mL.

    Larutan baku Timbang saksama sejumlah Retinil Asetat BPFI atau Retinil Palmitat BPFI, Encerkan dengan Pengencer hingga kadar retinol, C₂₀H₃₀O, 8,5 mg per mL. Pindahkan 10 mL larutan ke dalam labu Erlenmeyer 125 mL bersumbat, tambahkan 5 mL air, 5 mL Pengencer, 3 mL Larutan kalium hidroksida. Tutup rapat, kocok selama 15 menit diatas tangas air pada suhu 60±5° dan dinginkan hingga suhu ruang. Tambahkan 7 mL air dan 25,0 mL Pelarut ekstraksi. Tutup rapat, kocok kuat selama 60 detik. Bilas bagian labu dengan 60 mL air dan diamkan selama 10 menit hingga lapisan terpisah. Pipet lapisan organik untuk disuntikkan ke dalam kromatograf. Larutan baku mengandung retinol 3,4 mg per mL.

    Larutan uji kapsul Timbang tidak kurang dari 20 kapsul dalam botol timbang yang telah ditara. Buka kapsul, tanpa kehilangan bagian cangkang, masukkan isi ke dalam gelas piala 100 mL. Bilas dengan eter P untuk hilangkan semua isi yang masih menempel pada cangkang kapsul. Buang hasil bilasan dan keringkan cangkang kapsul dengan bantuan aliran udara. Timbang berat cangkang kapsul kosong dalam botol timbang yang telah ditara dan hitung berat bersih isi kapsul. Pindahkan sejumlah isi kapsul, setara dengan 1,3 mg retinol ke dalam labu Erlenmeyer 125 mL bersumbat. Tambahkan 5 mL air, 15 mL Pengencer dan 3 mL Larutan kalium hidroksida. Tutup rapat, kocok selama 15 menit diatas tangas air pada suhu 60±5° dan dinginkan hingga suhu ruang. Tambahkan 7 mL air dan 25,0 mL Pelarut ekstraksi. Tutup rapat, kocok kuat selama 60 detik atau lebih lama jika diperlukan sampai ekstraksi sempurna. Bilas labu dengan 60 mL air dan diamkan selama 10 menit sampai lapisan terpisah. [Catatan Tidak boleh dikocok, karena akan menyebabkan terbentuk emulsi.] Pipet lapisan organik jika perlu encerkan secara bertahap dan kuantitatif dengan Pelarut ekstraksi hingga kadar retinol 3,4 mg per mL.

    Larutan uji tablet Serbukkan sejumlah beberapa tablet. Timbang saksama sejumlah serbuk tablet setara dengan lebih kurang 1,3 mg retinol masukkan ke dalam labu Erlenmeyer 125 mL bersumbat. Tambahkan 5 mL air, 15 mL Pengencer, dan 3 mL Larutan kalium hidroksida. Tutup rapat, kocok selama 15 menit diatas tangas air pada suhu 60±5° dan dinginkan hingga suhu ruang. Tambahkan 7 mL air dan 25,0 mL Pelarut ekstraksi. Tutup rapat, kocok kuat selama 60 detik atau lebih lama jika diperlukan sampai ekstraksi sempurna. Bilas labu dengan 60 mL air dan diamkan selama 10 menit sampai lapisan terpisah. [Catatan Tidak boleh dikocok, karena akan menyebabkan terbentuk emulsi.] Pipet lapisan organik dan encerkan dengan Pelarut ekstraksi hingga kadar retinol 3,4 mg per mL.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan secara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 335 nm dan kolom 6,2 mm x 8 cm, berisi bahan pengisi L3. Laju alir lebih kurang 4 mL per menit. Pertahankan suhu kolom pada 40°. Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 3,0%.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 50 µl) Larutan baku  dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. Hitung persentase vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O_, dalam bagian vitamin A yang digunakan dengan rumus:

r_T1 dan r_T2 berturut-turut adalah jumlah respons puncak dari semua bentuk trans ester retinil dan 13-cis ester retinil Larutan uji dan Larutan baku; C_S adalah kadar retinol, C₂₀H₃₀O dalam mg per mL Larutan baku; dan C_U adalah kadar vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan jumlah yang tertera pada etiket.

Uji 4

    Prosedur ini dilakukan dengan ekstraksi cair-cair vitamin A dengan heksan P, uapkan heksan dan rekonstitusikan residu dalam campuran tetrahidrofuran  P-asetonitril P (1:1). Prosedur ini dapat digunakan untuk vitamin A dalam larutan oral vitamin larut dalam air dan minyak, larutan oral vitamin dan mineral yang larut dalam air dan minyak.

    Kecuali dinyatakan lain dalam monografi, Larutan baku, Larutan uji dan Pengencer dibuat sebagai berikut:

    Fase gerak Campuran metanol P-asetonitril P-n-heksan P (46,5:46,5:7,0).

    Pengencer Campuran tetrahidrofuran P-asetonitril P (1:1).

    Larutan baku Timbang saksama sejumlah Retinil Asetat BPFI atau Retinil Palmitat BPFI, larutkan dan encerkan dengan Pengencer hingga kadar retinol, C₂₀H₃₀O 0,33 mg per mL.

    Larutan uji sediaan cair Ukur saksama sejumlah volume larutan oral, setara dengan lebih kurang retinol 3,3 mg, masukkan ke dalam corong pisah 500-mL yang berisi 10 mL air dan 20 mL etanol mutlak P. Tambahkan 150 mL heksan P, tutup dan kocok selama 1 menit. Tambahkan lagi 150 mL heksan P, tutup, kocok dan diamkan hingga lapisan terpisah. Buang lapisan air dan saring ekstrak heksan melalui natrium sulfat anhidrat P ke dalam labu alas bulat 500 mL. Uapkan larutan hingga kering dengan bantuan penguap berputar pada tangas air suhu 65°. Segera tambahkan 10,0 mL Pengencer, goyang hingga residu larut dan saring.

    Sistem kromatografi Lakukan penetapan secara Kromatografi cair kinerja tinggi seperti tertera pada Kromatografi <931>. Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 265 nm dan kolom 4,6 mm x 50 cm (dibuat dari gabungan dua kolom 4,6 mm x 25 cm), berisi bahan pengisi L1. Laju alir lebih kurang 1,5 mL per menit. Pertahankan suhu kolom pada 40°. Lakukan kromatografi terhadap Larutan baku, rekam kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera pada Prosedur: simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 5,0%.

    Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 20 µl) Larutan baku  dan Larutan uji ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons puncak utama. Hitung persentase vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O_, dalam bagian vitamin A yang digunakan dengan rumus:

r_U dan r_S berturut-turut adalah respons puncak dari semua bentuk trans ester retinil Larutan uji dan Larutan baku; C_S adalah kadar retinol, C₂₀H₃₀O, dalam mg per mL Larutan baku; dan C_U adalah kadar vitamin A, sebagai retinol, C₂₀H₃₀O, dalam mg per mL Larutan uji berdasarkan jumlah yang tertera pada etiket.