Uji pirogen dimaksudkan untuk membatasi risiko reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada pemberian sediaan injeksi. Pengujian meliputi pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan sediaan uji secara intravena dan ditujukan untuk sediaan yang dapat ditoleransi oleh kelinci percobaan pada dosis tidak lebih dari  10 mL per kg yang disuntikkan secara intravena dalam periode tidak lebih dari 10 menit. Untuk sediaan yang memerlukan penyiapan pendahuluan atau cara pemberian khusus, ikuti petunjuk tambahan yang diberikan pada masing-masing monografi atau, dalam hal antibiotik  atau sediaan biologi petunjuk tambahan diberikan dalam ketentuan lain.

ALAT DAN PENGENCER

Alat suntik, jarum dan alat gelas dibebaskan dari pirogen dengan pemanasan pada 250° selama tidak kurang dari 30 menit atau dengan metode lain yang sesuai. Perlakukan semua pengencer dan larutan untuk mencuci dan membilas peralatan atau alat suntik parenteral sedemikian rupa yang dapat menjamin alat tersebut steril dan bebas pirogen. Lakukan uji pirogen pada pengencer dan larutan untuk pencuci atau pembilas alat secara berkala. Bila digunakan Injeksi Natrium Klorida sebagai pengencer, gunakan larutan yang mengandung natrium klorida 0,9%.

REKAMAN SUHU

Gunakan alat pendeteksi suhu yang teliti seperti termometer klinik atau alat termistor atau alat sejenis yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian ± 0,1° dan telah diuji untuk penetapan bahwa pembacaan maksimum dapat dicapai kurang dari 5 menit. Masukkan alat pendeteksi suhu ke dalam rektum kelinci uji dengan kedalaman tidak kurang dari 7,5 cm dan setelah periode waktu tidak kurang dari yang ditetapkan sebelumnya, catat suhu tubuh kelinci.

HEWAN UJI

Gunakan kelinci dewasa yang sehat. Tempatkan kelinci satu ekor dalam satu kandang dalam ruangan dengan suhu yang seragam antara 20-23° dan bebas dari gangguan yang menimbulkan kegelisahan. Perbedaan suhu tidak lebih dari ±3° dari suhu yang ditetapkan. Kelinci yang belum pernah digunakan untuk uji pirogen, adaptasikan kelinci tidak lebih dari tujuh hari dengan uji pendahuluan yang meliputi semua tahap yang tertera pada Prosedur, kecuali penyuntikan. Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali dalam waktu 48 jam, atau sebelum 2 minggu untuk uji pirogen yang menunjukkan kenaikan suhu 0,6° atau lebih,  atau telah digunakan untuk uji sediaan yang dinyatakan pirogenik.

PROSEDUR

Lakukan uji dalam ruang terpisah yang dirancang untuk pengujian pirogen dan pada  kondisi lingkungan yang sama dengan ruang pemeliharaan hewan dan bebas dari gangguan yang menimbulkan kegelisahan. Kelinci tidak diberi makan selama pengujian. Boleh diberi minum setiap saat, tetapi terbatas. Jika termistor pengukur suhu rektum digunakan untuk pengujian, kelinci diletakkan dalam penyekap yang dapat menahan kelinci dengan leher yang longgar sehingga dapat duduk dengan bebas. Tetapkan suhu kontrol dari tiap kelinci tidak lebih dari 30 menit sebelum penyuntikan larutan uji. Suhu tersebut digunakan sebagai awal untuk penetapan setiap kenaikan suhu yang dihasilkan dari penyuntikan larutan uji. Dalam setiap kelompok kelinci uji, gunakan kelinci yang mempunyai perbedaan suhu kontrol antara satu dengan lainnya tidak lebih dari 1°, dan suhu kontrol setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39,8°. Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, suntikkan 10 mL larutan uji per kg berat badan kedalam vena telinga setiap tiga kelinci, lakukan penyuntikan dalam waktu 10 menit. Larutan uji berupa sediaan yang perlu dikonstitusi sesuai etiket, atau bahan uji yang diperlakukan seperti tertera pada masing-masing monografi dan disuntikkan sesuai dosis tersebut. Untuk uji pirogen dari alat atau perangkat injeksi, gunakan cucian atau bilasan permukaan yang kontak dengan bahan yang diberikan secara parenteral, tempat penyuntikan atau jaringan tubuh pasien. Semua larutan uji harus terjamin bebas kontaminasi. Lakukan penyuntikan setelah larutan uji dihangatkan pada suhu 37±2°. Rekam suhu berturut-turut antara jam ke-1 dan ke-3 setelah penyuntikan dengan selang waktu 30 menit.

INTERPRETASI HASIL DAN LANJUTAN

Setiap penurunan suhu dianggap nol. Sediaan memenuhi syarat apabila tidak ada satupun kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu  0,5° atau lebih. Bila ada kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu 0,5° atau lebih, lanjutkan uji menggunakan lima ekor kelinci lain. Sediaan memenuhi syarat bebas pirogen bila tidak lebih dari 3 dari 8 ekor masing-masing menunjukkan kenaikan suhu 0,5° atau lebih dan jumlah kenaikan suhu maksimum 8 kelinci tidak melebihi 3,3°.

UJI REAKTIVITAS BIOLOGI SECARA IN-VITRO <241>

    Uji berikut dirancang untuk menentukan reaktivitas biologik biakan sel mamalia setelah kontak dengan plastik elastomer dan bahan polimer lain yang kontak dengan penderita secara langsung atau tidak langsung, atau dengan ekstrak khusus yang dibuat dari bahan uji. Hal yang penting adalah menyediakan luas permukaan spesifik untuk ekstraksi. Jika luas permukaan spesimen tidak dapat ditentukan, gunakan 0,1 g elastomer atau 0,2 g plastik atau bahan lain untuk setiap mL cairan ekstraksi. Juga penting berhati-hati dalam penyediaan bahan-bahan tersebut untuk menghindari kontaminasi mikroba dan zat asing lain.

    Tiga uji diuraikan di bawah ini: Uji Difusi Agar, Uji Kontak Langsung, dan Uji Evaluasi. Keputusan jenis uji atau jumlah uji yang dilakukan untuk menilai respons biologik potensial sampel atau ekstrak khusus tergantung dari bahan, produk akhir dan tujuan penggunaan. Faktor lain yang mungkin juga mempengaruhi kesesuaian sampel untuk suatu penggunaan khusus adalah komposisi polimer; prosedur pembuatan dan pembersihan; media kontak; tinta; perekat; absorbsi, adsorpsi dan permeabilitas pengawet; dan kondisi penyimpanan. Evaluasi terhadap faktor tersebut harus dilakukan dengan berbagai uji khusus tambahan sebelum menentukan bahwa produk yang dibuat dari suatu bahan khusus tepat untuk tujuan penggunaannya.

    Baku pembanding Bioreaksi Negatif BPFI; Bioreaksi Positif Padat BPFI; Ekstrak Bioreaksi Positif BPFI.

    Penyiapan Biakan Sel Buat biakan ganda sel fibroblas mamalia L-929 (ATCC cell line CCL1, NCTC klon 929) dalam media esensial minimum yang ditambah serum dan mempunyai kerapatan benih lebih kurang 10⁵ sel per mL. Inkubasi biakan pada suhu 37° ± 1° selama tidak kurang dari 24 jam dalam atmosfer karbon dioksida 5% ± 1%, sampai diperoleh lapisan tunggal sel dan kompak lebih dari 80%. Periksa di bawah mikroskop untuk memastikan biakan merupakan lapisan tunggal seragam dan hampir kompak. [Catatan Reprodusibilitas Uji Reaktivitas secara Biologi in-vitro tergantung pada kerapatan biakan sel yang seragam].

    Pelarut ekstraksi Injeksi natrium klorida seperti yang tertera pada Injeksi Natrium Klorida mengandung natrium klorida 0,9%. Sebagai pengganti, dapat digunakan media biakan sel mamalia bebas serum atau media biakan sel mamalia yang ditambahkan serum. Penambahan serum digunakan bila ekstraksi dilakukan pada suhu 37° selama 24 jam.

    Alat

    Otoklaf Gunakan otoklaf yang dapat mempertahankan suhu 121° ± 2°, dilengkapi dengan termometer, pengukur tekanan, lubang ventilasi, rak yang cukup untuk menampung wadah uji di atas permukaan air dan sistem pendingin air yang akan mendinginkan wadah uji sampai suhu lebih kurang 20°, tetapi tidak di bawah suhu 20°, segera setelah siklus pemanasan.

   Oven Gunakan oven, sebaiknya model konveksi mekanik yang akan mempertahankan rentang suhu kerja 50° sampai 70° dalam kisaran lebih kurang 2°.

    Inkubator Gunakan inkubator yang dapat mempertahankan suhu 37° ± 1° dan atmosfer karbon dioksida dalam udara 5% ± 1%. [Catatan Bila digunakan tabung biakan bertutup, atmosfer karbon dioksida dalam inkubator tidak diperlukan.]

    Wadah untuk ekstraksi Gunakan hanya wadah seperti ampul atau tabung biakan bertutup ulir, atau yang setara, yang dibuat dari kaca Tipe I. Bila digunakan tabung biakan, atau yang setara, bertutup ulir berlapis elastometer yang sesuai, seluruh permukaan lapisan elastometer yang terpapar dilindungi dengan cakram padat inert setebal 0,05 mm hingga 0,075 mm. Cakram yang sesuai dapat dibuat dari politetrafluoroetilen (politef).

    Penyiapan alat Bersihkan semua alat gelas dengan campuran pembersih asam kromat, bila perlu dengan asam nitrat panas, kemudian dibilas dengan air untuk injeksi P. Sterilkan wadah dan alat yang digunakan untuk ekstraksi, pemindahan, atau pemberian bahan uji dan keringkan dengan cara yang sesuai. Bila etilen oksida digunakan untuk sterilisasi, biarkan tidak kurang dari 48 jam untuk pengawaudaraan yang sempurna.

    Prosedur

    Penyiapan sampel untuk ekstrak Lakukan prosedur seperti yang tertera pada Uji Reaktivitas secara Biologi, in-vivo <251>.

    Penyiapan ekstrak Lakukan penyiapan ekstrak seperti yang tertera pada Penyiapan ekstrak dalam Uji Reaktivitas secara Biologi in-vivo <251>, menggunakan larutan Injeksi Natrium Klorida (natrium klorida 0,9%) atau media biakan sel mamalia bebas serum sebagai Pelarut ekstraksi. [Catatan Bila ekstraksi dilakukan pada suhu 37° selama 24 jam, dalam inkubator, gunakan media biakan sel yang ditambah serum. Kondisi ekstraksi tidak boleh menyebabkan perubahan fisik seperti fusi atau pelelehan potongan bahan kecuali sedikit perlengketan.]

Uji Difusi Agar

    Uji ini dirancang untuk tutup elastomer dalam berbagai bentuk. Lapisan agar berlaku sebagai bantalan untuk melindungi sel dari kerusakan mekanis dan sebagi sarana difusi bagi bahan kimia yang dapat terlepas dari spesimen polimer. Ekstrak bahan uji diletakkan di atas selembar kertas saring .

    Sampel Gunakan ekstrak yang telah dibuat seperti yang telah disebut atau gunakan bagian dari spesimen uji yang mempunyai permukaan datar dengan luas permukaan tidak kurang dari 100 mm².

    Prosedur Menggunakan 7 mL suspensi sel yang dibuat seperti tertera pada Penyiapan biakan sel, buat lapisan tunggal biakan sel pada lempeng berdiameter 60 mm. Setelah inkubasi, buang media biakan dari lapisan tunggal dengan pipet, dan sebagai ganti dengan media biakan yang ditambah serum dan mengandung agar P tidak lebih dari 2%. [Catatan Mutu agar harus cukup baik untuk menunjang pertumbuhan sel. Lapisan agar harus cukup tipis sehingga bahan kimia yang terlepas dapat berdifusi.] Tempelkan permukaan datar Sampel, Biorekasi Negatif BPFI (sebagai Kontrol negatif), dan Ekstrak Bioreaksi Positif BPFI atau Bioreaksi Positif Padat BPFI (sebagai Kontrol positif) dalam biakan duplo pada permukaan agar yang telah memadat. Gunakan tidak lebih dari 3 spesimen per lempeng. Inkubasi semua biakan pada suhu 37° ± 1° selama tidak kurang 24 jam, sebaiknya dalam inkubator lembab yang mengandung karbon dioksida 5% ± 1%. Amati masing-masing biakan pada tiap Sampel, Kontrol negatif dan kontrol positif, di bawah mikroskop, bila perlu dengan menggunakan pewarna sitokimia.

    Interpretasi hasil Reaktivitas biologik (degenerasi dan malformasi sel) digambarkan dan diberi skala 0 sampai 4 (seperti yang tertera pada Tabel 1). Ukur respons yang diperoleh dari Kontrol negatif  dan Kontrol positif. Sistem uji ini sesuai bila respons yang diamati sesuai dengan derajat reaktivitas biologik yang tertera pada penandaan baku pembanding. Ukur respons yang diperoleh dari Sampel. Sampel memenuhi persyaratan uji bila tidak satupun biakan sel yang terpapar terhadap Sampel menunjukkan reaktivitas lebih besar dari reaktivitas ringan (Tingkat 2). Ulangi uji ini bila tidak ada kesesuaian sistem.

Tabel 1 Tingkatan Reaktivitas untuk Uji Difusi Agar dan Uji Kontak Langsung

Uji Kontak Langsung

    Uji ini dirancang untuk bahan dalam berbagai bentuk. Prosedur memungkinkan ekstraksi bersaman dan pengujian bahan kimia yang dapat lepas dari spesimen dengan media yang ditambah serum. Prosedur ini tidak sesuai untuk bahan dengan kerapatan sangat rendah atau sangat tinggi yang dapat menyebabkan kerusakan mekanis pada sel.

    Sampel Gunakan bagian dari spesimen uji yang mempunyai permukaan datar dengan luas permukaan tidak kurang dari 100 mm².

    Prosedur Dengan menggunakan 2 mL suspensi sel yang dibuat seperti yang tertera pada Penyiapan biakan sel, buat lapisan tunggal biakan sel pada lempeng berdiameter 35 mm. Setelah inkubasi, buang media biakan dengan pipet, dan ganti dengan 0,8 mL media biakan segar. Tempatkan Sampel tunggal, Biorekasi Negatif BPFI (sebagai Kontrol negatif), dan Ekstrak Bioreaksi Positif BPFI atau Bioreaksi Positif Padat BPFI (sebagai Kontrol positif) pada masing-masing biakan rangkap dua. Inkubasi semua biakan pada suhu 37° ± 1° selama tidak kurang 24 jam, sebaiknya dalam inkubator lembab yang mengandung karbon dioksida 5% ± 1%. Amati setiap biakan pada tiap Sampel, Kontrol negatif, dan Kontrol positif secara visual atau dengan mikroskop bila perlu dengan menggunakan pewarna sitokimia.

    Interpretasi hasil Lakukan sesuai tertera pada Interpretasi hasil pada Uji Difusi Agar. Sampel memenuhi persyaratan uji bila tidak satupun biakan sel yang terpapar terhadap Sampel menunjukkan reaktivitas lebih besar dari reaktivitas ringan (Tingkat 2). Ulangi uji ini bila tidak ada kesesuaian sistem.

Uji Eluasi

    Uji ini dirancang untuk mengevaluasi ekstrak bahan polimer. Prosedur memungkinkan ekstraksi spesimen pada suhu fisiologik atau nonfisologik untuk berbagai interval waktu. Uji ini sesuai untuk bahan dengan kerapatan tinggi dan untuk evaluasi dosis-respons.

    Sampel Lakukan seperti yang tertera pada Penyiapan ekstrak, menggunakan Injeksi Natrium Klorida (natrium klorida 0,9%) atau media biakan sel mamalia bebas serum sebagai Pelarut ekstraksi. Bila Sampel tidak dapat dengan mudah diukur, dapat digunakan tidak kurang dari 0,1 g bahan elastomer atau 0,2 g plastik atau bahan polimer per mL media ekstraksi. Sebagai cara lain, gunakan media biakan sel mamalia yang ditambah serum sebagai media ekstraksi untuk lebih mendekati kondisi fisiologis. Buat ekstrak dengan memanaskan selama 24 jam dalam inkubator yang sebaikanya mengandung karbon dioksida 5% ± 1%. Pertahankan suhu ekstraksi pada 37° ± 1°, karena suhu yang lebih tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein serum.

    Prosedur Dengan menggunakan 2 mL suspensi sel yang dibuat seperti yang tertera pada Penyiapan biakan sel, buat lapisan tunggal biakan sel pada lempeng berdiameter 35 mm. Setelah inkubasi, buang media biakan dari lapisan tunggal dengan pipet, dan ganti dengan ekstrak Sampel, Biorekasi Negatif BPFI (sebagai Kontrol negatif) dan Ekstrak Bioreaksi Positif BPFI. Ekstrak yang dibuat dengan media biakan sel yang beabs serum maupun yang ditambah serum diuji rangkap dua tanpa pengenceran (100%). Ekstrak larutan injeksi natrium klorida diencerkan dengan media biakan sel yang ditambah serum dan diuji rangkap dua pada kadar ekstrak 25%. Inkubasi semua biakan pada suhu 37° ± 1° selama 48 jam, dalam inkubator yang sebaiknya mengandung karbon dioksida 5% ± 1%. Periksa setiap biakan pada 48 jam di bawah mikroskop jika perlu menggunakan pewarna sitokimia.

    Interpretasi hasil Lakukan sesuai yang tertera pada Interpretasi hasil pada Uji Difusi Agar tetapi gunakan tabel 2. Ulangi uji ini bila tidak ada kesesuaian sistem. Sampel memenuhi persyaratan uji bila biakan yang diperlakukan dengan Sampel menunjukkan reaktivitas tidak lebih besar dari reaktivitas ringan (Tingkat 2). Bila biakan yang diperlakukan dengan Sampel menunjukkan reaktivitas yang lebih besar secara bermakna dibandingkan biakan yang diberi Kontrol negatif, ulangi uji dengan berbagai pengenceran ekstrak secara kuantitatif.

Tabel 2 Tingkatan Reaktivitas untuk Uji Elusi